Molekylærbiologisk diagnostikk ved bein- og bløtvevssvulster

Genetikk

Morfologi er basis for all patologidiagnostikk, men tilleggsmetoder som immunhistokjemi, ultrastrukturell patologi og etter hvert genetiske analyser er blitt metoder som nå inngår i rutinediagnostikken av flere svulster. Det er beskrevet spesifikke genetiske forandringer i flere benigne og maligne svulster (tab 1, tab 2) (8, 9).

Sarkomer kan inndeles i to undergrupper cytogenetisk (8). Den ene gruppen har en nærdiploid karyotype med få kromosomforandringer, mens de andre har en kompleks karyotype med mange cytogenetiske avvik. Eksempler på de førstnevnte er Ewings sarkom, alveolært rhabdomyosarkom og synovialt sarkom, som alle er karakterisert ved patognomoniske kromosomtranslokasjoner blant ellers stort sett normale kromosomer. Disse translokasjonene danner fusjonsgener som koder for aberrante transkripsjonsfaktorer eller proteiner involvert i vekstfaktorsignalveier. Man har her både en diagnostisk verdi og i tillegg en pekepinn for å forstå den molekylære patogenesen. Dette likner på mange måter det vi ser i leukemier og er helt ulikt det som registreres i de fleste karsinomer. I denne gruppen hører også gastrointestinale svulster (GIST), som ofte har aktiverende mutasjoner i genet for c-kit.

Det er flere metoder som kan benyttes for å påvise de genetiske funn. Karyotypering er en screeningmetode som er viktig for å kartlegge kromosomforandringer i ulike svulster. Fordelen med slik «cytogenetisk» analyse er at man ikke trenger å velge hva slags genforandring man skal undersøke på, men metoden gir svar i kun 50 – 70 % av analysene på solide svulster (10). Resolusjonsnivået er lavt og gir ikke presis informasjon på gennivå. Således kan mindre avvik lett gå uoppdaget. Ved komplekse karyotyper er det vanskelig å identifisere hvilke kromosomsegmenter som er involvert. Man kan kun bruke vitalt, ufiksert vev.

På grunnlag av de kjente fusjonsgenene og kjente mutasjoner kan man lage prober som sammen med polymerasekjedereaksjon (PCR) raskt kan gi svar på om en prøve er positiv for en bestemt genforandring. Dette, i tillegg til bruk av fluorescerende in situ-hybridisering (FISH), er de vanligste metoder for å få genetisk informasjon. PCR-teknikker og fluorescerende in situ-hybridisering kan i tillegg anvendes på frosset vev, cytologisk materiale samt på parafininnstøpt vev.

EWS-genet kan være involvert i flere translokasjoner, ikke bare i Ewings sarkom/PNET, men også i svulster som myksoid/rundcellet liposarkom, desmoplastisk rund- og småcellet tumor, ekstraskeletalt myksoid kondrosarkom og klarcellet sarkom (fig 1) (8). I Ewings sarkom er det også flere varianter av genfusjoner mellom EWS og Fli1, og prognosen er rapportert å være bedre ved den vanligste genfusjonen mellom ekson 7 fra EWS og ekson 6 fra FLI-1(2). I synovialt sarkom er det også liknende varianter av genfusjoner mellom SYT og henholdsvis SSX1 og SSX2, der SYT-SSX1 er knyttet til bifasisk vekstmønster og dårligere prognose. Identifisering av disse genfusjoner vil derved hjelpe til å sette en presis diagnose og av til gi prognostisk informasjon. Dette kan bli viktig for styring av behandling hos disse pasienter.

I denne gruppen finner vi også veldifferensierte liposarkomer, som har merkelige, kompliserte ring- eller stavformede markørkromosomer i en ellers normal karyotype. Her er det ingen åpenbare translokasjoner, men markørkromosomene inneholder amplifiserte deler fra flere kromosomer, særlig 1 og 12 (fig 2). På kromosom 12 er det vist at MDM2-genet, som koder for et protein som blokkerer «bremseproteinet» p53, alltid er amplifisert (11), mens man også finner skjulte translokasjoner av HMGA₂-genet, som ligger i nærheten (12). Spesielt interessant er det at HMGA₂-genet er translokert i (godartede) lipomer, mens det i disse ondartede svulstene også er amplifisert og dermed uttrykkes på mye høyere nivå (13).

Sarkomer med kompleks karyotype oppstår ofte i en eldre aldersgruppe, og noen typiske svulster er malignt fibrøst histiocytom (pleomorft sarkom), leiomyosarkom samt osteosarkom (som allikevel hyppigst ses hos yngre). Til denne gruppen hører også de stråleinduserte sarkomer. I denne gruppen er det mindre kjent hvilke spesifikke gener som er involvert, men moderne genomiske screeningteknikker, særlig mikromatrise (microarray)-baserte, globale analyser av genenes aktivitet og kopitall, er i ferd med å avsløre hvilke prosesser som er involvert i utviklingen av disse svulstene (14). Man antar at slike studier vil lede frem til et mindre sett med informative gener som kan undersøkes med mer rutinepregede metoder. Det er derfor håp om at vi de neste årene vil få bedre grunnlag for å diagnostisere og behandle også denne typen kreft.

En rekke andre genavvik i kjente gener er allerede påvist i sarkomer. Mutasjoner i det sentrale «bremsegenet» TP53 er vanlig her som ved de fleste krefttyper, men typisk for sarkomer er at p53-basert regulering av cellesyklus og -død også kan være hemmet ved overproduksjon av et protein som blokkerer p53, nemlig MDM2. Genet for MDM2 er ofte amplifisert i flere typer sarkomer, men nesten aldri i svulster der p53 er inaktivert ved mutasjon (15). Dette skyldes nok at det er tilstrekkelig med én mekanisme for inaktivering av p53-reguleringen. Siden p53 ser ut til å være intakt i disse svulstene, er det spennende at nye designermolekyler utvikles og kan blokkere bindingen til mdm2, og dermed tillate p53 å gjøre jobben sin (16, 17). Når kreftceller med amplifikasjon av MDM2 behandles med slike stoffer, aktiveres p53 og derved programmert celledød. Selv om dette synes å være skreddersydd og effektiv kreftterapi, er det et tankekors at denne lille pasientgruppen neppe gir tilstrekkelig økonomisk grunnlag til at slike medisiner vil nå frem til markedet. Et annet viktig spørsmål er hvordan p53 eller effekten av denne er inaktivert i de svulstene der vi ikke finner mutasjoner eller amplifikasjon av MDM2

Det andre «store» bremsegenet, RB1, som koder for retinoblastomproteinet, pRB, er også sentralt i sarkomer. På samme måte som for p53-reguleringen, ser man at det er nok i hver svulst at et av leddene i kjeden er inaktivert, enten pRB selv eller ett av de proteinene som er kritiske i reguleringsprosessen. For eksempel er ofte CDK4-genet, som også ligger på kromosom 12, ofte amplifisert (19, 20), og dette koder for en kinase som inaktiverer pRB ved fosforylering. I andre tilfeller kan denne kinasen være overaktiv, fordi den ikke hemmes som normalt av p16-proteinet, som kodes for et gen på kromosom 9 som ofte er deletert (17).

Eksempler på områder der genundersøkelser er viktige, er i differensialdiagnosen mellom ulike små- og rundcellede svulster, f.eks. mellom synovialt sarkom, Ewings sarkom, malignt lymfom og rhabdomyosarkom samt i noen tilfeller mellom metastatisk melanom og klarcellet sarkom. Ved diagnostikk av små- og rundcellede svulster er det viktig at den preoperative diagnosen er korrekt, da disse pasienter oftest får preoperativ kjemoterapi. Dette medfører at det meste av tumorvevet er nekrotisk ved operasjonsøyeblikket og kan umuliggjøre en senere diagnose. Patologen har her en viktig funksjon for å sikre at man analyserer representativt materiale. Fluorescerende in situ-hybridisering med en såkalt «break-apart»- probe er et velegnet verktøy for å påvise omstokking av EWS-genet. Her vil man ved en positiv prøve finne to separate lyssignaler som tyder på separasjon av de normale gensegmentene. Imidlertid kan man ikke si hvilken eventuell fusjonspartner som er aktuell, men sammen med morfologi og immunhistokjemi og eventuelt mer spesifikke genetiske analyser vil man kunne nå en presis diagnose.

Fluorescerende in situ-hybridisering kan også brukes for å påvise spesifikke translokasjoner, da bruker man prober som hybridiserer på hver sin side av det nye fusjonsgenet. RT-PCR er en rask metode som ofte brukes ved påvisning av translokasjoner i de små- og rundcellede svulster. Meget lite vev er nødvendig.

Videre har man stor nytte av cytogenetikk i lipomatøse svulster. På morfologisk grunnlag er det av og til meget vanskelig å skille et intramuskulært lipom fra et høyt differensiert liposarkom. Funn av flertallige ringkromosomer cytogenetisk støtter da at det kan være et liposarkom. I myksoide og rundcellede liposarkomer er det to beskrevne patognomoniske translokasjoner. At man finner de samme i disse to undergrupper, har bidratt til at man har forstått at det er en og samme tumor, og at rundcellet liposarkom bare er en mindre differensiert variant av denne maligne fettumor.

Det anbefales at det i disse sjeldne tumorgruppene tas av vev til cytogenetiske analyser av de fleste svulster og spesielt hos alle som er under 40 år, ved alle små- og rundcellede svulster samt ved lipomatøse svulster. Man skal også alltid prøve å sikre frosset vev til diagnostikk og tumorbank.