()

    sporsmal_grey_rgb
    Abstract
    Bakgrunn

    Bakgrunn

    . Påvisning av nukleinsyrer fra mikrober er blitt en viktig del av mikrobiologisk diagnostikk. I denne artikkelen presenteres en oppdatering innen feltet.

    Materiale og metode

    Materiale og metode

    . Oversiktsartikkelen er basert på egne erfaringer og søk i Medline, med gjennomgang av relevant litteratur.

    Resultater og diskusjon

    Resultater og diskusjon

    . Amplifikasjonsteknikker for nukleinsyre står sentralt i denne utviklingen. Sekvensering, hybridisering og elektroforetiske separasjonsmetoder anvendes også ved ulike problemstillinger. I de senere år har instrumentutvikling for automatisk nukleinsyrerensing og sanntids-PCR gitt nye fremskritt. Analysetiden er kortet ned, kapasiteten er økt og sårbarheten for prøveforbytting er redusert. Et økende repertoar av nukleinsyreanalyser er tilgjengelig for påvisning av mikrobiologiske agenser og virulensgener i tillegg til genotyping og monitorering av medikamentresistens og behandlingsrespons.

    Abstract

    Background.

    Detection of nucleic acids from infectious agents now has a fundamental role in diagnostic microbiology laboratories. Nucleic acid amplification methods have promoted this development.

    Material and methods.

    In this study we give a review of the field based on searches in Medline and our own experience.

    Results and interpretation.

    Nucleic acid sequencing, hybridisation and electrophoresis complement the gene technology available for microbiological diagnosis. Recently, equipment for automated extraction of nucleic acids and real-time quantitative PCR has contributed to faster, more reliable and robust nucleic acid detection. An increasing number of microbiological agents and virulence genes can now be diagnosed in a variety of patient samples and supplemented with additional nucleic acid-based methods for genotyping and quantitative monitoring of drug resistance and therapeutic response.

    Artikkel

    Påvisning av nukleinsyrer i mikrobiologisk diagnostikk ble første gang omtalt i Tidsskriftet i 1987 (1). Aktuelle metoder og diagnostikk er presentert flere ganger, senest i 1999 i en temaserie (2, 3).

    I denne perioden har genteknologiske metoder som hybridisering, nukleinsyreamplifikasjon og DNA-sekvensering utviklet seg fra å være spennende fremtidsvyer til å utgjøre en stor del av den daglige diagnostikken.

    Nukleinsyrediagnostikk, påvisning eller karakterisering av arvestoffet til mikrobiologiske agenser, er i stadig utvikling – med konsekvenser for rask diagnostikk, behandlingsindikasjon og monitorering av behandlingsrespons eller tilbakefall, spesifikk påvisning av virulensfaktorer og medikamentresistens. En tabellarisk oversikt over alle mikrobiologiske nukleinsyretester er blitt vanskelig innenfor formatet av en oversiktsartikkel. I ramme 1 er i stedet listet Internett-adresser som gir oversikt over nukleinsyretester som i dag utføres ved ulike norske mikrobiologiske laboratorier. Tabell 1 viser eksempler på undersøkelser som er aktuelle ved utvalgte kliniske problemstillinger.

    Internett-adresser til noen sentrale mikrobiologiske laboratorier som utfører mikrobiologisk nukleinsyrediagnostikk

    www.stolav.no/mikrobiologi – St. Olavs Hospital

    www.unn.no/fagfolk/handbok/labhandbok/mikrobiologisk – Universitetssykehuset Nord-Norge

    www.rikshospitalet.no/content/res_bibl/3529.pdfRikshospitalet

    www.ulleval.no/default.asp?file=mikro.xml – Ullevål universitetssykehus

    www.helse-bergen.no/avd/ami/ – Haukeland Universitetssjukehus

    www.fhi.no/ – Folkehelseinstituttet

    www.ahus.no/index.aspAkershus universitetssykehus

    www.telelab.noTelelab, Skien

    Tabell 1

    Nukleinsyrediagnostikk ved enkelte kliniske problemstillinger i Norge i 2005

    Problemstilling

    Agenspåvisning (tilleggsundersøkelse)

    Encefalitt – meningitt

    Enterovirus (genotyping)

    Epstein-Barr-virus (kvantitering)

    Herpes simplex-virus 1 og 2

    Humant herpesvirus 6

    Varicella-zoster-virus

    Listeria monocytogenes

    Neisseria meningitidis

    Toxoplasma gondii

    Øyeinfeksjon

    Adenovirus (genotyping)

    Herpes simplex-virus 1 og 2

    Chlamydia trachomatis

    Nedre luftveisinfeksjon

    Adenovirus (genotyping)

    Influensa A-virus

    Influensa B-virus

    Metapneumovirus

    Respiratorisk syncytialt virus

    Rhinovirus

    SARS-coronavirus

    Bordetella pertussis

    Chlamydia pneumoniae

    Legionella pneumophila

    Mycoplasma pneumoniae

    Mycobacterium tuberculosis

    Andre mykobakterier

    Streptococcus pneumoniae

    Peri- og myokarditt

    Adenovirus

    Enterovirus (genotyping)

    Hepatitt

    Hepatitt A-virus

    Hepatitt B-virus (kvantitering, genotyping, resistens)

    Hepatitt C-virus ((kvantitering, genotyping)

    Gastroenteritt, diaré

    Adenovirus

    Norovirus

    Enterohemoragisk E coli (EHEC)

    Enteroinvasiv E coli (EIEC)

    Enteropatogen E coli (EPEC)

    Enterotoksigen E coli (ETEC)

    Urogenital infeksjon

    Chlamydia trachomatis

    Mycoplasma genitalium

    Neisseria gonorrhoeae

    Cancer cervicis uteri, kondylomer

    Humane papillomavirus(genotyping)

    Immunsvikt

    HIV (kvantitering, resistens)

    Antibiotikaresistens

    Enterokokker (vanA, -B, -C1/2)

    Gule stafylokokker (mecA)

    Mycobacterium tuberculosis (katG)

    Abort, kongenitt/perinatal Infeksjon

    Enterovirus

    Cytomegalovirus

    Herpes simplex-virus 1 og 2

    Parvovirus B19

    Toxoplasma gondii

    Prøvetaking og nukleinsyreekstraksjon

    Prøvetaking og nukleinsyreekstraksjon

    Undersøkelse med henblikk på DNA eller RNA fra et spesifikt agens kan utføres i en rekke forskjellige prøvematerialer, som blod, serum, spinalvæske, ekspektorat, urin, feces, amnionvæske, biopsi, sårsekret eller laboratoriekulturer. Den nukleinsyren som skal påvises, kan være labil RNA eller mer stabil DNA. Nukleinsyren kan være beskyttet av cellevegg og kapsel i bakterier. I enkelte tilfeller finnes det spesielle prøvetakingssett som preserverer arvestoffet. Ellers bør man under prøvetaking følge anvisningen fra det mikrobiologiske laboratorium, og prøven bør sikres rask transport.

    Både mekaniske og enzymatiske rensetrinn kan være nødvendig for å sikre intakt nukleinsyre som er fri for hemmere av den påfølgende amplifikasjonsprosessen.Noen prøvematerialer trenger lite forbehandling dersom de skal undersøkes for DNA-virus. En bakteriekultur som skal undersøkes for et virulensgen, kan slemmes opp i vann og kokes og bunnfall sedimenteres før PCR (polymerasekjedereaksjon) utføres i supernatanten. Men for DNA-undersøkelser i de fleste prøvematerialer, og alltid når RNA skal påvises, er en skikkelig ekstraksjonsprosedyre for nukleinsyrer nødvendig. Det er spesielt viktig med enzymatisk forbehandling for påvisning av DNA fra små mengder av grampositive bakterier, hvor celleveggen kan være vanskelig å ødelegge (4).

    Amplifikasjonsteknikker for nukleinsyre

    Amplifikasjonsteknikker for nukleinsyre

    Den tidligste nukleinsyrediagnostikk var basert på hybridisering med spesifikke genprober, noe som for pasientmateriale medførte lav sensitivitet og dermed begrenset anvendelse (1). PCR er prototypen på den nukleinsyreamplifikasjon som er blitt fundamentet for praktisk nukleinsyrediagnostikk. TMA (transkripsjonsmediert amplifikasjon), NASBA (nucleic acid sequence-based amplification), LCR (ligasekjedereaksjon) og SDA (strand displacement amplification) er andre varianter av målamplifikasjonsteknikker (5). Også signalamplifikasjonsteknikker som bDNA (branched DNA) er utviklet (5), men i det videre blir kun PCR omtalt.

    Ut fra nukleinsyresekvensen til et agens kan mindre områder av arvestoffet oppformeres fra ett molekyl til millioner av kopier som visualiseres indirekte. Et par korte oligonukleotider (såkalte primere) som flankerer en avgrenset kjent gensekvens, blir konstruert og kan leveres i løpet av noen dager etter bestilling. Det er den eksakte oligonukleotidsekvens av primerparet som bestemmer spesifisiteten ved PCR. Dataprogrammer kan gjennomsøke databanker for alle kjente gensekvenser for å bekrefte at et primerpar spesifikt vil amplifisere DNA fra kun det aktuelle agens. Teknikkens store fordel er at når spesifisiteten er sikret gjennom oligonukleotidsyntesen, er reagenser og metodologi for øvrig nokså like for alle agenser man ønsker å påvise. Dette er noe av bakgrunnen for at SARS-coronavirus (SARS-CoV) kunne påvises med PCR i de fleste vestlige land bare få måneder etter at den nye sykdommen ble oppdaget. Den viktigste årsaken er imidlertid at virusgenomet raskt ble klonet og sekvensert (6).

    Selv om metodene egner seg for maskinell automatisering, har manuell pipettering og arbeid med enkeltrør gjennom mange trinn karakterisert mikrobiologisk nukleinsyrediagnostikk frem til nylig. Trass i den tilsynelatende enkelheten har PCR-prosedyren derfor i praksis likevel vært arbeidskrevende og sårbar for menneskelige feil. Det er her det nå skjer avgjørende forandringer.

    Automatisering, strekkoding, seriekobling og datastyring

    Automatisering, strekkoding, seriekobling og datastyring

    En rekke automatiserte instrumenter for ekstraksjon av RNA og DNA er nå tilgjengelige. Prøvematerialet forsynes med en strekkode som følger prøven gjennom rensetrinnene. Koden følger den videre gjennom serien av PCR-amplifikasjon, visualisering og digital registrering i et dataprogram. Dette eliminerer faren for prøveforbytting ved manuelle prosedyrer. Metodikken blir mer robust og standardisert.

    Kvantitativ sanntids-PCR

    Kvantitativ sanntids-PCR

    Prinsippet for kvantitativ sanntids-PCR er det samme som for konvensjonell PCR (7, 8). Også vanlig PCR kan automatiseres. Den store forskjell mellom PCR og sanntids-PCR er at det i tillegg til to oligonukleotidprimere blir konstruert en genprobe som er spesifikk for sekvensen mellom primerne. Ved ulike prinsipper – som TaqMan, molekylære nebb, FRET – blir det produsert økende fluorescens i prøven jo mer spesifikk DNA-sekvens det blir dannet (9). Kontinuerlig eksitasjon og samtidig registrering av fluorescenssignalet indikerer derfor spesifikk amplifikasjon i sanntid.

    Ved konvensjonell PCR er det sluttproduktet som detekteres etter at amplifikasjonen har nådd en platåfase. Ved sanntids-PCR blir amplifikasjonen registrert ved terskelverdien for deteksjon og gjennom den påfølgende lineære del av amplifikasjonen. Ved hjelp av standardkurver og kontroller kan mengden spesifikk nukleinsyre i utgangsmaterialet bli kalkulert i et dataprogram. Genproben som er rettet mot den amplifiserte sekvensen mellom de to primerne, øker analysens spesifisitet betydelig. Konvensjonell PCR må, for å nærme seg tilsvarende sensitivitet og spesifisitet, kjøres som en flettet PCR (nested PCR) i to trinn, eller amplifikasjonsproduktet må detekteres i en påfølgende separat undersøkelse med en «capture-probe» og enzymkatalysert fargereaksjon. Flettet PCR er inntil 1 000 ganger mer sensitiv og langt mer spesifikk enn konvensjonell PCR (10). Sanntids-PCR kvantiterer i tillegg mengden arvestoffsekvens i utgangsmaterialet og foregår meget raskt (ca. 30 – 90 minutter) i ett trinn. Dermed unngås i stor grad prøveforbytting eller krysskontaminering, som kan være problemer ved flettet PCR i separate trinn.

    Kvantitative metoder basert på sanntids-PCR har mange fordeler fremfor de konvensjonelle PCR-metodene. De er raskere, enklere å utføre, har et større dynamisk måleområde og bedre presisjon i det øvre måleområdet (10).

    Verdien av kvantitative bestemmelser

    Verdien av kvantitative bestemmelser

    Det kan være tvil om klinisk relevans selv om en mikrobiell sekvens er sikkert påvist i en pasientprøve ved hjelp av kvalitativ PCR. Ett eksempel er infeksjon med cytomegalovirus (CMV). Dette viruset persisterer, som andre herpesvirus, vanligvis livet ut etter gjennomgått primærinfeksjon. Intermitterende reaktiveringer av latent virus med lavgradig replikasjon i endotelceller og leukocytter forløper vanligvis asymptomatisk hos immunfriske personer. Hos immunsvekkede pasienter, prematurt fødte og transplantasjonspasienter kan cytomegalovirusinfeksjon imidlertid være alvorlig. En kvantitativ bestemmelse av CMV-DNA i plasma, leukocytter eller fullblod kan da gi indikasjon for behandling. Samtidig er kvantitering nyttig for monitorering av behandlingsrespons (11).

    Påvisning av transkribert RNA ved hjelp av cDNA-syntese i et uavhengig første trinn fulgt av nukleinsyreamplifikasjon er et alternativt kriterium for aktiv infeksjon (12).

    Medikamentell behandling av HIV-infeksjon, hepatitt C (13, 14) og hepatitt B (15) er basert på tilsvarende kvantitering og monitorering av virus.

    Invasive soppinfeksjoner er en fryktet komplikasjon ved leukemi og beinmargstransplantasjon. In vivo-bildeteknikker og antigentester har her gitt diagnostiske fremskritt. DNA-påvisning må være kvantitativ for å gi sikre holdepunkter for diagnose og behandling, ettersom minimale mengder nukleinsyre fra ikke-invasiv sopp lett kan kontaminere prøven (16).

    Kommersielt tilgjengelige kvantitative tester til bestemmelse av virusmengde baseres på en kompetitiv amplifikasjon av virustemplat sammen med en kjent mengde syntetisert DNA (standard) som tilsettes hvert reaksjonsrør. Til slutt detekteres den relative mengde av virus- og standardamplikon, og resultatet leses fra en standardkurve som etableres parallelt i samme oppsett. Ved vurdering av virusmengde på grunnlag av slike undersøkelser er det viktig å være fortrolig med egenskapene til den metoden som benyttes og begrensninger i metodens reproduserbarhet.

    Inntil nylig har kvantiteringsenhetene som benyttes ved de forskjellige metodene ikke uttrykt samme mengde virusnukleinsyre i prøvematerialet, fordi hver metode har hatt sin egen standard av varierende lengde og sekvenser utviklet av produsenten. Resultatene av de forskjellige metoder utført på samme prøve er derfor ikke sammenliknbare, men angis oftest likevel med samme benevning, kopier eller ekvivalenter per milliliter. Denne mangelen på standardisering har begrenset nytteverdien og gjort det vanskelig å sammenlikne resultater fra ulike metoder (17). For å løse dette problemet har WHO utarbeidet internasjonale standarder for hepatitt C-virus (HCV) (18), hepatitt B-virus (HBV) (15) og parvovirus B19 (19) til metodekalibrering som gir sammenliknbare resultater i internasjonale enheter (International Units per milliliter – IU/ml).

    Metodenes presisjonsnivå og reproduserbarhet bedres stadig, men fortsatt er det slik at variasjoner i resultat med en og samme metode på < 0,5 log10 ikke kan anses som signifikante endringer (14). Et måleresultat på for eksempel 500 000 IU/ml vil med en måleusikkerhet på ± 0,5 log10 innebære at sann verdi kan ligge på fra 160 000 IU/ml til 1 600 000 IU/ml.

    DNA sekvensbestemmelse og genotyping

    DNA sekvensbestemmelse og genotyping

    PCR-amplifisert DNA brukes for påvisning og kvantitering av mikrobiologiske agenser i et pasientmateriale. Det amplifiserte DNA kan også benyttes til sekvensundersøkelser, som ofte gir tilleggsopplysninger (20). Moderne medikamentell behandling av HIV-infeksjon har drastisk forbedret prognosen for pasientene. Resistens mot ett eller flere medikamenter er assosiert med typiske mutasjoner i HIV-RNA. Påvisning av slike mutasjoner er i dag helt nødvendig for å kunne skreddersy kombinasjonsbehandling og for å skille mellom resistensutvikling og dårlig etterlevelse når virusmengden i plasma stiger under behandlingen (21). Ved behandling av kronisk aktiv hepatitt B med lamivudin er resistensutvikling et notorisk problem som også er assosiert med typiske mutasjoner i HBV-genomet (22). Andre former for DNA-sekvensering som blir gjort i Norge inkluderer typebestemmelser av enterovirus og adenovirus. DNA-sekvensbestemmelse er fortsatt en metodikk med begrenset kapasitet. Dersom det dreier seg om påvisning av en definert sekvensvariant som en genotype, er strategier med høyere kapasitet utviklet – for eksempel differensiell hybridisering eller «line probe assays». Hepatitt C-virus forekommer som flere genotyper. Både prognose og varighet av PEG-interferon-α/ribavirinbehandling avhenger av genotypen (14). Rundt 120 ulike typer humane papillomavirus (HPV) er påvist. Definisjonen av en ny type er < 90 % DNA-sekvenshomologi i bestemte områder av det strukturelle L1-genet og de regulatoriske og potensielt onkogene E6- og E7-gener. Lavrisikotyper forårsaker kun vorter og aldri kreft, som f.eks. HPV-6 og HPV-11 i kjønnsvorter. Vel 15 høyrisikotyper, inkludert HPV-16 og HPV-18, er vanligvis en nødvendig, men ikke tilstrekkelig årsak til livmorhalskreft (23). Strategier for å supplere cervixcytologiscreening med deteksjon av HPV-høyrisikotyper for kvinner over 30 år og ved oppfølging av dysplasi er under utarbeiding og evaluering (24).

    Bakterielle undersøkelser

    Bakterielle undersøkelser

    Nukleinsyrebaserte metoder er i dag blitt et viktig redskap også innen bakteriologisk diagnostikk (25). Amplifikasjonsmetoder egner seg godt til påvisning av bakterier som er vanskelige å dyrke (f.eks. Chlamydia pneumoniae og Mycoplasma pneumoniae) eller som ikke lar seg dyrke (Tropheryma whipplei) (5). Disse metodene kan også benyttes til rask påvisning av bakterier i prøvematerialer ved mistanke om alvorlige infeksjoner, som for eksempel blod/blodkultur og spinalvæske, og kan dessuten detektere bakterier som er døde eller antibiotikapåvirket slik at de ikke lar seg dyrke eller påvise ved klassiske bakteriologiske metoder (25). Det kan imidlertid ta flere uker før DNA fra døde bakterier blir eliminert, og dette kan vanskeliggjøre tolkingen av positive PCR-resultater (se omtale av vurderingen av kontrollprøver etter behandling for Chlamydia trachomatis nedenfor).

    Nukleinsyrediagnostikk egner seg også godt for påvisning av mykobakterier og andre bakterier som vokser svært langsomt. Sekvensering av genet som koder for 16S ribosomalt RNA er mye brukt for identifikasjon av bakterier som er vanskelige å klassifisere med tradisjonelle biokjemiske og immunologiske metoder. Dette har gitt ny genetisk innsikt, som igjen har fått konsekvenser for den taksonomiske inndelingen av enkelte bakterier.

    I bakteriologien blir PCR brukt til påvisning av meticillinresistens (mecA) i Staphylococcus aureus, vancomycinresistens (vanA, vanB, vanC) i enterokokker og rifampicin- og isoniazidresistens (katG) i Mycobacterium tuberculosis. Ved siden av påvisning av gener for antibiotikaresistens er deteksjon av virulensgener (EHEC, EPEC, skarlatinatoksin, stafylokokktoksin) viktig i bakteriologisk diagnostikk. Nukleinsyrebaserte metoder er også viktige redskaper for epidemiologisk kartlegging av utbruddsstammer (MRSA,Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa m.fl.). En rekke spesialteknikker er utviklet til dette formål, f.eks. PFGE (pulsed field gel electrophoresis), AFLP (amplified fragment-length polymorphism), RAPD (random amplified polymorphic DNA), MLST (multi locus sequence typing) og DNA-fingerprinting (26, 27).

    Nukleinsyrediagnostikk i allmennpraksis

    Nukleinsyrediagnostikk i allmennpraksis

    Primærlegen rekvirerer alt i dag et stort volum Chlamydia trachomatis-undersøkelser (mer enn 250 000 prøver/år i Norge) fra cervix og urethra. Metoder for nukleinsyreamplifikasjon har forbedret muligheten for overvåking av urogenital C trachomatis-infeksjon. Sensitiviteten er så høy at nukleinsyre fra denne intracellulære bakterien kan påvises i epitel lenge etter adekvat antibiotikabehandling, og dersom det er ønskelig med kontroll etter behandling, må prøve tidligst tas etter en måned. Bruken av amplifikasjonstester har også åpnet for bruk av andre prøvematerialer, for eksempel urin og vaginalpensel (28, 29). Undersøkelse for HCV-RNA i plasma eller serum rekvireres også hyppig av primærlegen.

    Immunfluorescensundersøkelse av nasopharynxaspirat for påvisning av antigen fra respiratorisk syncytialt virus, parainfluensavirus, influensavirus og adenovirus er nyttig når småbarn blir hospitalisert med stridor. Men PCR-påvisning er også tilgjengelig for disse virus og andre virus som kan gi luftveisinfeksjon og influensaliknende sykdom, inkludert metapneumovirus og SARS-CoV. Ved alvorlig nedre luftveisinfeksjon finnes det også tilbud om PCR for Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae og Bordetella pertussis fra samme prøve.

    Serologiske undersøkelser basert på komplementbindingsreaksjonen har ofte begrenset sensitivitet for mange luftveisagenser. På den annen side er over 50 % av alle øvre luftveisinfeksjoner forårsaket av rhinovirus og coronavirus, og mikrobiologisk diagnostikk er vanligvis ikke påkrevd. Dersom luftveisinfeksjoner i hovedsak skal bli gjenstand for nukleinsyrediagnostikk med dagens teknologi, vil belastningen på helsebudsjettet øke betydelig, uten at det er åpenbart at dette vil gjenspeiles i en tilsvarende helsegevinst.

    Kvalitetskontroll og sikkerhetskrav

    Kvalitetskontroll og sikkerhetskrav

    Egenutviklede varianter av nukleinsyretester er i utstrakt bruk, også i Norge. Dette har medført viktig kompetansebygging og muligheter til å utvikle diagnostiske metoder for nye agenser før kommersielle tester er tilgjengelige (20, 30). Egenutviklede tester kan også gi innsparinger i forhold til innkjøp av kommersielle tester, men stiller samtidig store krav til standardisering og kontrollerbarhet. Ofte vil kommersielt tilgjengelige analyser derfor bli foretrukket. En ulempe ved at multinasjonale selskaper med ressurser til utvikling og kvalitetssikring overtar markedet, er at reagenskostnadene oftest blir betydelig høyere. Spørsmålet blir ikke bare hva som rent teknisk kan påvises og hvor raskt, men hva den samfunnsøkonomiske belastningen vil bli.

    Erfaringene med å inkludere nukleinsyretestene i de nasjonale ringtester er svært gode. Dette representerer verdifull kvalitetssikring som bør opprettholdes og utvikles. Det finnes også gode og relativt rimelige europeiske ringtestordninger, for eksempel det EU-baserte Quality Control for Molecular Diagnostics (QCMD).

    Fremtidsutsikter

    Fremtidsutsikter

    Det er grunn til å være kritisk både til kostnadene forbundet med de ulike metodene og til deres anvendelsesområder. I mange sammenhenger er tradisjonell diagnostikk med immunologiske teknikker fremdeles å foretrekke, mens nukleinsyrebaserte metoder kan være et nyttig og nødvendig supplement. På andre områder er nukleinsyrediagnostikk helt nødvendig og en forutsetning for å sikre store pasientgrupper nødvendig diagnostikk og behandling og for å kunne møte nye utfordringer. Det er nok å nevne SARS, trusselen om en forestående influensapandemi og det økende problem med antibiotikaresistens for å illustrere viktigheten av nukleinsyrediagnostikken. Det er derfor avgjørende at norske mikrobiologiske laboratorier rustes til å møte kravene til moderne diagnostikk, både ved vedlikehold og bygging av kompetanse og ved å sikres tilgang til tekniske løsninger.

    Den viktigste nyvinning i mikrobiologisk nukleinsyrediagnostikk de siste fem årene er automatisert nukleinsyreekstraksjon og kvantitativ sanntids-PCR. Strekkoding og robotisert seriekobling av rensetrinn – sanntids-PCR-dataregistrering – gir fortsatt stort rom for forbedring av nukleinsyrediagnostikken.

    Til undersøkelse av genekspresjon for forskningsformål finnes i dag kort i såkalt LDA-format (low density array). Dette er kort med 384 småbrønner som inneholder primere og probe for en TaqMan-sanntids-PCR. I dette formatet kan kvantitativ sanntids-PCR kjøres på inntil 381 forskjellige sekvenser samtidig i 2 l reaksjonsvolum. Det virker fristende å utvikle et liknende format for mikrobiologisk diagnostikk.

    DNA-mikromatriseteknologien har enda større kapasitet enn LDA-PCR. I dag kan oligonukleotider som representerer spesifikke sekvenser, avsettes på inntil 50 000 ulike punkter i et vanlig objektglassformat. Alternativt kan noen tusen sekvenser repeteres i for eksempel ti identiske felter, slik at ti ulike pasientprøver kan undersøkes på ett objektglass. Mikromatriseteknologien vil imidlertid kreve en uspesifikk foramplifikasjon av nukleinsyre i pasientprøven, er beheftet med uspesifikk krysshybridisering og har et langt smalere dynamisk signalområde enn sanntids-PCR.

    Det er vanskelig å anslå hvilken plass disse nyere teknologiene vil få i fremtidig diagnostikk. Det som imidlertid synes klart, er at nukleinsyrediagnostikken i det kommende tiåret vil fortsette å utvikle seg med henblikk på repertoar, kapasitet, sensitivitet og spesifisitet og dermed fortsette å revolusjonere mikrobiologisk diagnostikk.

    Manuskriptet ble godkjent 23.6. 2005.

    Oppgitte interessekonflikter: Ingen

    PDF
    Skriv ut

    Anbefalte artikler

    Laget av Ramsalt med Ramsalt Media