Resultater og diskusjon
Vi har interessert oss for svulster utgått fra nevroendokrine celler, slik som de klassiske karsinoidene og småcellet lungekarsinom. Nevroendokrine celler er karakterisert ved spesifikke sekretoriske granula som finnes i cytoplasma. Man får under tumorprogrediering en dedifferensiering av cellene med tap av slike granula (10, 11). Studerer man spekteret av nevroendokrine svulster i lungene, finner man at de veldifferensierte karsinoidene inneholder tumorceller med rikelig antall sekretoriske granula. På den annen side har man de udifferensierte småcellede lungekarsinomene, hvor tumorcellene inneholder svært få granula (12). Dette tapet av sekretoriske granula i dedifferensierte maligne nevroendokrine celler fører til at det blir vanskelig å påvise de få eksisterende granula med vanlige immunhistokjemiske teknikker.
Hvis man undersøker småcellede lungekarsinomer med henblikk på CgA, som er en generell markør for nevroendokrine sekretoriske granula (13), vil bare en andel av tumorcellene være immunreaktive ved bruk av konvensjonell metodikk (14, 15). I de mest dedifferensierte svulstene vil man ofte ikke finne CgA-immunreaktivitet i det hele tatt (fig 2). Man kan likevel påvise granula (ofte atypiske) ved elektronmikroskopisk undersøkelse, men dette er altfor ressurskrevende i vanlig praksis. Ved bruk av TSA-teknikken kan man derimot tydelig få frem immunreaktivitet for CgA i de fleste tilfeller (fig 2). Vi undersøkte nylig biopsier fra en pasient med en uvanlig form for ovarialcancer. Histopatologiske snitt fra svulsten ble vurdert av flere erfarne patologer, og man kom til slutt frem til at det var et karsinom av sannsynlig nevroendokrin opprinnelse. Ved immunhistokjemi viste et lite antall av tumorcellene en noe usikker, svak immunreaktivitet mot CgA, men i store deler av biopsien var det ingen tegn til immunreaktivitet (fig 3). Ved hjelp av TSA-teknikken ble derimot de fleste tumorcellene distinkt immunreaktive (fig 3), og diagnosen nevroendokrint karsinom kunne dermed bekreftes.
I de senere år har det vært diskutert om en andel av adenokarsinomene i ventrikkelen egentlig er nevroendokrine karsinomer (16). Det er kjent at nevroendokrine svulster både kan danne kjertelstrukturer (17) og vise positiv mucinfarging (18), slik som adenokarsinomer. Dette vanskeliggjør korrekt klassifisering, siden nevroendokrine granula i dedifferensierte tumorceller ofte ikke lar seg påvise ved konvensjonelle teknikker (11). Vår gruppe har tidligere undersøkt ventrikkelcancer med tanke med tanke på nevroendokrin differensiering ved hjelp av en rekke metoder (elektronmikroskopi, immunhistokjemi, Northern blot m.m.) og funnet at en andel av disse svulstene sannsynligvis er nevroendokrine karsinomer (19). Ved å bruke TSA-teknikken på det samme tumormaterialet har vår gruppe nylig kunnet vise tilsvarende resultater ved bruk av denne teknikken alene (20), noe som ytterligere understreker metodens sensitivitet. Disse resultatene tyder på at vanlige metoder i en del tilfeller mangler tilstrekkelig sensitivitet til at man kan gjøre en korrekt klassifikasjon av svulstene.
I flere studier har man sammenliknet vanlige immunhistokjemiske metoder med og uten tillegg av TSA-teknikken. Det viser seg at den økte følsomheten som man oppnår ved bruk av TSA-teknikken gir mulighet for å øke fortynningen av primærantistoffet mellom hundre og tusen ganger og likevel oppnå samme signalintensitet som man har med de vanlige metodene alene (8, 9, 21). Vi har valgt å beholde samme konsentrasjon av primærantistoffet som ved vår vanlige metode (ABC-teknikken) og heller utnytte signalforsterkingen til å studere antigener med liten utbredelse som er vanskelig å påvise med tradisjonelle metoder. Dette har vist seg å gi nyttig tilleggsinformasjon i mange tilfeller.
TSA-teknikken bygger videre på allerede etablerte immunhistokjemiske metoder, og spesifisiteten bestemmes av antistoffene (fig 1). På grunn av teknikkens høye sensitivitet, stiller den store krav til spesifisiteten av antistoffene for å unngå uønsket bakgrunnsfarging. I tillegg må fortynninger og inkubering av de ulike reagenser tilpasses individuelt for hvert antistoff. Men, når disse faktorene er klarlagt, er resultatene svært reproduserbare, og man kan bruke standardiserte protokoller. På grunn av den til dels betydelige forsterkingen av signalet man får ved bruk av TSA-teknikken, er det viktig å være nøyaktig med bruk av negative kontroller. Enkelte antistoffer som tilsynelatende gir en spesifikk reaksjon med vanlige metoder, viser seg å gi en betydelig uspesifikk farging når signalet forsterkes.
Det er nå gått sju år siden TSA-teknikken ble introdusert, men foreløpig synes det å være en noe begrenset interesse knyttet til metoden. Den er teknisk lett å utføre, og det har nå kommet kommersielle utstyrssett, både for immunhistokjemi og for in situ-hybridisering. Metoden må foreløpig gjøres manuelt og krever en del utprøvninger for hvert enkelt primærantistoff, noe som nok begrenser bruken i en travel hverdag. I tillegg kan mange diagnostiske problemer løses ved vanlige immunhistokjemiske teknikker. Vi tror likevel at TSA-teknikken vil bli et viktig supplement i histopatologisk diagnostikk, spesielt for klassifisering av maligne svulster, da vi erfarer at man ved konvensjonelle metoder ofte ikke klarer å påvise cellulære markører i dedifferensierte svulstceller. TSA-teknikken vil også kunne gi avgjørende informasjon i andre problemstillinger hvor man vil påvise proteiner med liten utbredelse.