Intracellulær hemning av HIV
Genterapi som tar sikte på intracellulær hemning av HIV, kan enten være basert på interferens eller modulering av virale nukleinsyrer eller av virale eller cellulære proteiner (2, 3).
Terapi basert på virale nukleinsyrer . Disse terapiformene faller i to hovedgrupper:
-
– RNA-baserte strategier basert på antisens, ribozymer, eller ”decoys” (”lokkeduemolekyler”)
-
– Eksogent tilførte, syntetiske DNA-oligonukleotider med antisensegenskaper.
-
– Antisens. Ved antisensterapi introduseres et gen i målcellene som fører til ekspresjon av RNA-molekyler, komplementære til det virus-RNA man ønsker å angripe (4). Dette fører til spesifikk binding av det terapeutiske RNA til det virale målmolekylet, noe som gir blokkering av funksjon og/eller nedbrytning av dette molekylet (fig 3). Fase-I-studier hos HIV-pasienter er i dag i gang med antisensterapi rettet mot følgende viktige virale målmolekyler: den såkalte TAR-sekvensen; budbringer-RNA for rev-genet; pol-genet; viralt genom RNA (5).
– Ribozymer. Ribozymer er antisensmolekyler med enzymatisk effekt, slik at de etter binding til de virale RNA-molekyler som representerer målet, forårsaker ødeleggelse av disse. Ribozymmolekylene er så vidt små at flere ulike ribozymer med forskjellig angrepspunkt kan bygges inn i samme vektorsystem, samtidig som det er mulig å konstruere ribozymmolekyler som angriper på ulike steder i det virale RNA samtidig.
Ribozymer kan angripe viralt RNA både før og etter at virusets arvestoff er bygd inn i vertscellens kromosomale DNA (2, 3). Videre er det lovende foreløpige resultater av forsøk på å manipulere ribozymmolekylenes bygning slik at de kan styres mer direkte til de områder i den HIV-infiserte celle hvor deres mål-RNA finnes.
Flere fase-I-studier er i dag i gang med ribozymterapi, men resultater er foreløpig ikke publisert (7, 8). Et vesentlig problem også her er risikoen for at viruset skal utvikle mutanter resistente mot det anvendte ribozym. Også denne terapiformen vil derfor etter all sannsynlighet måtte anvendes i kombinasjonsopplegg.
– ”Decoys” (”lokkeduemolekyler”). Områdene TAR og RRE på viralt RNA representerer viktige bindingssteder for de sentrale regulatoriske virusproteinene, Tat og Rev, og denne bindingen kan blokkeres genterapeutisk ved ”decoy”-strategi. Denne er basert på innføring av et gen i vertscellene som uttrykker korte RNA-molekyler, som er strukturlike med virusets TAR og RRE (1 – 3). ”Decoy”-molekylene vil så binde de regulatoriske virusproteinene Tat og Rev (fig 4), og slik ”lokke” dem vekk fra TAR og RRE. I cellekulturer har dette prinsippet betydelig antiviral effekt. Det er imidlertid en viss bekymring for at denne formen for genterapi kan medføre potensielt alvorlige bivirkninger, siden den ”naturlige” bindingen mellom Tat og Rev på den ene siden, og deres korresponderende RNA på den annen, også involverer binding av vertscelleproteiner som derved kan avledes fra normale cellefunksjoner (6). Det arbeides for å konstruere ”decoy”-molekyler som ikke lenger binder slike celleproteiner. De første fase I-studiene er nå i gang med ”decoy”-strategi som beskrevet, men kliniske resultater foreligger ikke.
– DNA-oligonukleotider. Også her dreier det seg om et antisensprinsipp idet utenfra tilførte oligonukleotider designes slik at de gir spesifikk binding til det virale budbringer-RNA som er målmolekylene (6). Dette blokkerer budbringer-RNA slik at det korresponderende virusproteinet ikke syntetiseres i cellen. Disse terapiformene har et meget stort potensial. De er effektive i cellekultureksperimenter, og har også vist seg å forsterke virkningen av konvensjonelle anti-HIV-medikamenter in vitro. Innledende fase I-eksperimenter med et slikt oligonukleotid (GEM 91) rettet mot budbringer-RNA for gag-genet i virusgenomet, er allerede publisert (9), og en forbedring av dette molekylet (GEM 92) vil trolig snarlig bli satt i klinisk prøving.
Terapi basert på intracellulære proteiner med anti-HIV-effekt . Som vist i tabell 2, er flere strategier aktuelle med sikte på å hemme funksjonen av virale eller cellulære proteiner i den infiserte celle (2, 3).
– Dominant negative proteiner. Man tar her sikte på å innføre gener eller genfragmenter som leder til syntese av proteiner nær beslektet med viktige virusproteiner, men uten visse essensielle egenskaper ved ”naturlig” virusprotein (5, 6, 10). Slike modifiserte proteiner vil ha antiviral virkning dels ved at de konkurrerer med det ”naturlige” virusprotein om bindingssteder på virus-RNA, dels ved at de beslaglegger cellulære faktorer som inngår i den ”naturlige” binding mellom virusprotein og virus-RNA, og endelig ved at de danner komplekser med det normalt forekommende virusproteinet og derved nøytraliserer dette (fig 5). En rekke virale proteiner er angrepet med denne strategien i cellekulturforsøk. Lengst i klinisk utnyttelse er man kommet med innføring av et gen som koder for et modifisert Rev-protein (Rev M10) og i hvert fall to kliniske fase-I-studier er i gang (10, 11). Kliniske resultater av denne strategien er ennå ikke publisert. Av betydelig interesse er det at man har klart å fremstille et protein som representerer en kombinasjon av endrede Tat- og Rev-proteiner. Innføring av gensekvensen for dette proteinet i dyrkede celler har en betydelig anti-HIV-effekt, og genet har derfor et klart potensial for genterapi (3, 6).
Et mulig problem ved genterapi basert på dominante negative proteiner er at disse vertsfremmede proteinene kan tenkes å utløse et immunsvar når de uttrykkes i modifiserte vertsceller, som derved kan bli destruert, slik at den terapeutiske effekt oppheves.
– Cellulære proteiner. Innføring av gener som koder for cellulære proteiner, dvs. proteiner av vertsopprinnelse som har anti-HIV-effekt, kan også tenkes benyttet ved genterapi av HIV-infeksjon (6). CD4-molekylet uttrykkes på overflaten av CD4-positive lymfocytter og har evnen til å binde HIV. I cellekulturer er det vist at celler hvor man har introdusert genet for et modifisert CD4-molekyl som holdes tilbake i cellens cytoplasma, har en viss anti-HIV-effekt, men dette er foreløpig ikke forsøkt in vivo. Heller ikke introduksjonen av genet for humant alfa-2-interferon som i cellekulturer har en klar anti-HIV-effekt, har vært brakt videre i kliniske forsøk, delvis fordi muligheten av bivirkninger med denne strategien er til stede. Også introduksjon av genet for betainterferon har gitt interessante resultater i kulturer av celler både fra HIV-pasienter og fra normale individer. Man kan på denne måten oppnå en vedvarende lav produksjon av betainterferon som har en klar HIV-effekt og i tillegg bedrer cellenes immunologiske funksjon. Kliniske forsøk er ennå ikke publisert med denne strategien.
– ”Intrabodies”. Det lar seg gjøre å innføre et gen i vertsceller, blant annet CD4-lymfocytter, som gir syntese av såkalte ”intrabodies”, dvs. antigenbindende enkeltkjedefragmenter avledet av ordinære antistoffmolekyler (fig 6). Slike ”intrabodies” som kan konstrueres slik at de reagerer selektivt med essensielle HIV-proteiner, kan hemme virusreplikasjon i cellekulturer (3, 6). De første fase-I-forsøk hos HIV-pasienter er allerede i gang med genterapi basert på ”intrabodies” mot Rev-proteinet og mot HIV-1 gp 120 (Env). Ingen kliniske resultater er kjent ennå.
– Selvmordsgener. I cellekulturer har det latt seg gjøre å innføre flere forskjellige selvmordsgener som direkte eller indirekte fører til cellens død, hvis den blir infisert med HIV. Dette kan gjøres for eksempel ved innføring av gen for difteritoksin, og ved innføring av tymidinkinasegenet fra herpes simplex-virus, som medfører celledød hvis cellene utsettes for virusmedikamentet ganciklovir (3, 6). Kliniske forsøk med denne strategien er ennå ikke utført.