Vekstfaktorer som nevroprotektiv behandling ved Parkinsons sykdom?

Reidun Torp, Preet Bano Singh, Dag R. Sørensen, Espen Dietrichs, Henry Hirschberg Om forfatterne
Artikkel

Omtrent 8 000 nordmenn har Parkinsons sykdom, som er en kronisk nevrodegenerativ lidelse. Debutalderen ligger på ca. 60 år. Sykdommen skyldes et gradvis tap av hjerneceller. Tapet skjer først og fremst i et lite område i hjernestammen, substantia nigra, men mange andre områder kan være affisert. Noen hevder at det er andre kjerner som først blir rammet (1). Cellene i substantia nigra sender nervefibrer til nucleus caudatus og putamen i basalgangliene, der de skiller ut signalstoffet dopamin. Når cellene i substantia nigra forsvinner etter hvert som sykdommen utvikler seg, forsvinner også nervefibrene til basalgangliene, og resultatet blir stor mangel på dopamin. Dette gir seg særlig utslag i form av motoriske symptomer.

Hos to av tre debuterer sykdommen med lett skjelving i en kroppshalvdel (hviletremor). Etter hvert utvikler det seg typiske tegn som «maskeansikt» (redusert ansiktsmimikk), fremoverlutende kroppsholdning og korte og trippende skritt ved gange. Stemmen kan bli lavere og mindre kraftfull, og det er vanlig med dysartri. Ustøhet, dårlig balanse og tendens til å falle er vanligvis tegn som først opptrer etter en tids sykdom. Det gjelder også mer uttalt akinesi og alvorlig bevegelsesinnskrenkning som immobiliserer pasienten. I tillegg kan sykdommen bringe med seg en rekke ikke-motoriske plager, slik som depresjon og andre psykiske forandringer, søvnproblemer, generell tretthetsfølelse, blæreforstyrrelse, demens og annet (2). Alvorlighetsgrad og utviklingshastighet varierer fra person til person, men sykdommen representerer et betydelig handikap for pasienten. Dessuten utgjør den et stort samfunnsøkonomisk problem, ikke minst på grunn av et betydelig pleiebehov hos mange med langtkommen sykdom.

Årsakene til Parkinsons sykdom er i det aller fleste tilfeller ukjent. Sykdommen synes å opptre sporadisk, men det finnes også forskjellige genetiske betingede former, både autosomalt recessive og autosomalt dominante. Kjente genetiske årsaker ligger bak i 2 – 4 % av tilfellene (3).

Dagens behandling innebærer å dempe symptomene så godt som mulig. Ved hjelp av en kombinasjon av forskjellige medikamenter er det ofte mulig å lindre symptomene effektivt i mange år. Etter hvert som tiden går og sykdommen utvikler seg, får stadig flere pasienter komplikasjoner i form av dårlig og uforutsigbar behandlingseffekt (4). Hos noen kan også dette kontrolleres, da med kirurgisk behandling med implantasjon av hjernestimulator (5). Men også slik intervensjon er ren symptombehandling. Selv om pasientene får en betydelig bedret situasjon, hindres ikke sykdommen i å progrediere.

Transplantasjon av hjerneceller fra aborterte fostre har vært prøvd. Av etiske og juridiske årsaker er det ikke aktuelt med slike behandlingsforsøk i Norge. Dessuten har dobbeltblinde studier ikke kunnet vise sikker effekt av slike transplantasjoner (6). Stamcelletransplantasjon blir testet i dyreforsøk i mange land, men også disse forsøkene har vært beheftet med betydelige problemer og har foreløpig ikke ledet frem til anvendbar behandling (7).

Siden Parkinsons sykdom er progredierende, er håpet å finne frem til nevroprotektive strategier som bremser den degenerative prosessen, eventuelt stopper sykdomsutviklingen i en tidlig fase. Selv hos pasienter med langt fremskreden sykdom overlever mange dopaminerge fibrer. En av flere eksisterende teorier for å forklare sykdommen postulerer at hjernen ikke danner tilstrekkelige mengder av vekstfaktorer til å holde de dopaminerge nervecellene i live etter eventuell eksponering for hittil ukjente toksiner. Gliaceller kan produsere trofiske faktorer som beskytter nevroner, slik som gliacellelinjederivert nevrotrofisk faktor (GDNF) og hjernederivert nevrotrofisk faktor (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) (8, 9). Ut fra denne hypotesen har vi studert vekstfaktorenes innvirkning i hjernevevet ved å infundere henholdsvis GDNF og BDNF i en eksperimentell rottemodell for Parkinsons sykdom. Forsøkene har vist markert forbedring av motorisk kontroll – både ved behandling med GDNF og med BDNF alene, men mest uttalt ved en kombinasjon av disse. Vi gir her en oversikt over konseptet nevroproteksjon ved Parkinsons sykdom basert på litteratur og egne forsøk.

Materiale og metode

Dyremodeller er nødvendig for å kunne forstå patogenese og behandling av Parkinsons sykdom. Siden dyr ikke utvikler sykdommen spontant, må de karakteristiske funksjonelle trekkene etterliknes ved bruk av nevrotoksiske agenser. Den eldste og mest brukte modellen er stereotaktisk innsprøyting av 6-hydroksydopamin (6-OHDA) i substantia nigra hos rotter. Vi har benyttet denne modellen, blant annet fordi reproduserbarheten er stor og lesjonene veldefinerte. Stoffet rammer de katekolaminerge fibrene og gir 80 – 90 % tap av de dopaminerge synapser i striatum (tilsvarende nucleus caudatus og putamen hos menneske). Den selektive celledøden skyldes antakeligvis akkumulering av toksinet i de dopaminerge cellene, noe som fører til ødeleggelse via oksidativt stress.

Dyrene ble inndelt i tre grupper (seks rotter i hver), hvorpå alle ble utsatt for selektiv ødeleggelse av de dopaminerge cellene i substantia nigra. Gruppene ble behandlet med henholdsvis saltvann, GDNF og GDNF-BDNF. I forsøkene ble saltvann eller vekstfaktor infundert direkte i hjernevevet ved hjelp av osmotiske minipumper, lokalisert subkutant, med et kateter koblet til en kanyle som ble plassert stereotaktisk i det aktuelle området i hjernen (striatum). Implantasjon av osmotiske minipumper ble foretatt samme dag som lesjonene ble laget ved injeksjon av 6-OHDA. Vekstfaktorene ble infundert over en periode på 28 dager. De osmotiske pumpene har den fordelen at de gir fra seg kontrollerte mengder, men det er begrensninger både når det gjelder diffusjonsdistanse og varighet av behandling. Motorisk test ble utført ved å injisere apomorfin systemisk. Slike dyr, men ikke friske rotter, roterer (går i ring) når de tilføres apomorfin. Antall rotasjoner per minutt ble målt hos rotter behandlet med 6-OHDA og vekstfaktorer og sammenliknet med antall rotasjoner hos rotter behandlet med 6-OHDA og saltvann (kontrollrotter). I hver gruppe ble seks dyr testet.

Mikroskopiske analyser

Både lys- og elektronmikroskopiske analyser ble foretatt for å evaluere hvorvidt vekstfaktorene påvirket overlevelsen av de dopaminerge fibrene i striatum. Antistoffer rettet mot tyrosinhydroksylase (TH) ble benyttet som markør for de dopaminerge fibrene. Proteinene Ki-67 og nestin ble brukt som markører for prolifererende celler.

Resultater

Etter behandling i 28 dager ble dyrene underkastet en motorisk test ved injeksjon av apomorfin. Seks dyr i hver gruppe ble testet. De som var behandlet med vekstfaktorer, hadde færre rotasjoner per minutt enn kontrolldyrene: Dyr behandlet med GDNF-BDNF hadde 0 – 3 roteringer, dyr behandlet med GDNF 0 – 5 roteringer, kontrolldyrene 10 – 12 roteringer.

Immuncytokjemiske studier med antistoff rettet mot tyrosinhydroksylase viste bortfall av dopaminerge celler i substantia nigra hos samtlige dyr. Gruppen med kombinasjonsterapien GDNF-BDNF hadde betydelige flere resterende fibrer i terminalområdet (striatum) enn kontrollgruppen (fig 1). Tilførsel av vekstfaktorer førte også til en proliferasjon av subventrikulære celler, som anses for å være den viktigste populasjon av endogene stamceller i den voksne hjernen. Prolifererende celler ble observert i en migrerende strøm av celler lateralt for infusjonsstedet hos vekstfaktorbehandlede dyr, mens det ikke var migrasjon av de samme cellene hos kontrolldyrene (fig 2). Cellene uttrykte både Ki67 og nestin, noe som tydet på at de var aktive progenitorceller. Siden de var negative for både gliale (GFAP-merking) og modne nervecellemarkører (Neu-N-merking), er det uvisst hvorvidt de vil utvikle seg til modne celler.

Figur 1  Snitt gjennom hjernen etter en unilateral injeksjon av 6-OHDA i en dyremodell for Parkinsons sykdom. a) De dopaminerge cellene i substantia nigra ødelegges unilateralt (piler). b) Saltvannsbehandlede dyr viser bortfall av TH-positive fibrer på ipsilaterale side. c) GDNF-BDNF-behandlede dyr viser mange intakte dopaminerge fibrer på ipsilaterale side. (SN: substantia nigra. CPu: nucleus caudatus og putamen)

Figur 2  Snitt gjennom basalgangliene etter injeksjon med 6-OHDA og behandling. a) Rektangelet viser hvor utsnittene b og c er fotografert. b) Migrerende celler (rød farge) ut fra den subventrikulære sonen etter kombinasjonsbehandling med GDNF-BDNF. c) Kontrolldyrene viser ingen migrasjon av celler og cellene forblir i den subventrikulære sonen (rød farge). Snittene er dobbeltmerket med gliamarkøren GFAP (grønn farge). (LV: lateralveggen i sideventrikkelen. CPu: nucleus caudatus og putamen)

Diskusjon

Nervevekstfaktorbehandling av Parkinsons sykdom er en helt ny metode som har vist seg å være svært lovende (8). Både våre egne og andres forsøk i en rottemodell har demonstrert betydelig effekt av infusjon av vekstfaktorer i hjernen (8 – 10). Også transgene mus har vist at det noradrenerge system er mer resistent for degenerasjon når GDNF overuttrykkes (11). Våre studier viser at infusjon av GDNF-BDNF i kombinasjon fører til redusert tap av dopaminerge nerveterminaler i basalgangliene i dyr behandlet med 6-OHDA. Tilleggseffekten av prolifererende celler fra den subventrikulære sonen og ut i parenkymet er en ny observasjon ved denne kombinasjonsterapien, som muligens er med på å danne et gunstig miljø for opprettholdelse av dopaminerge fibrer. De første forsøk på vekstfaktorbehandling hos mennesker viste oppløftende resultater (12, 13). Pasientene viste stor fremgang både når det gjaldt motorikk og motivasjon, og de hadde fremdeles effekt av behandlingen ved oppfølging to år senere. Til tross for lovende resultater er det interesse for alternative metoder for å tilføre vekstfaktor til relevante områder i hjernen.

Langtidsbehandling med vekstfaktorer

Langtidsbehandling er nødvendig dersom vekstfaktorer skal kunne anvendes klinisk. Det er derfor ønskelig å forbedre metodene for tilførsel av vekstfaktorer til basalgangliene. Både hos dyr og mennesker har man så langt benyttet en pumpe implantert under huden med en slange tilkoblet en kanyle som leverer vekstfaktor inn i hjernen. Transplantasjon av innkapslede celler som konstitutivt gir fra seg nevrotrofiske faktorer til omgivelsene er en ny og lovende form for langtidsbehandling (14). Hovedtrekkene ved denne metoden er at de innkapslede cellene kan overleve i lange perioder fordi de semipermeable membranene tillater diffusjon av næringsstoffer, men forhindrer en immunologisk respons. Og vekstfaktormengden som avgis, kan titreres ved å regulere celletallet i kapslene. Alginatgelene utnyttes på en slik måte at cellelinjer som er genmanipulert til å produsere GDNF eller BDNF, blir skjermet fra det ytre miljø og immunsystemet. De lipofile alginatsfærene huser hver og en til sammen om lag 100 celler, som stereotaktisk kan implanteres både i basalgangliene og i substantia nigra i våre eksperimentelle modeller. Disse alginatene har vist seg å være atoksiske og immunologisk inerte (15).

Dyremodeller

Så langt har 6-OHDA-modellen vært vårt hovedverktøy. Den er godt egnet der man ønsker å studere kvantitativt en akutt motorisk effekt, men egner seg mindre bra ved behandlingsstrategier der man tar sikte på nevroproteksjon over tid. Vi planlegger å arbeide med modeller som gir langsomt innsettende skader. Én mulighet er å injisere 6-OHDA i små mengder inn i striatum (16). Det gir mindre komplett ødeleggelse av cellene og langsommere degenerering av det nigrostriatale system. Metoden er derfor velegnet for nevroproteksjonsstudier. En annen mulighet er å administrere pesticidet rotenon, som, hvis gitt intraperitonalt, raskt krysser blod-hjerne-barrieren og hemmer elektrontransporten i mitokondriene og på den måten gir cellulær skade (17). Administreres stoffet flere ganger, er det også ødeleggende for de nigrostriatale dopaminerge cellene, dog i mildere grad enn ved bruk av 6-OHDA (18). Det ideelle ville være å studere en dyremodell som eksponerer alle karakteristika ved Parkinsons sykdom. I mangel på en slik ideell modell velger vi å bruke én akutt og én kronisk modell, både for å kunne forstå patogenesen og for å kunne vurdere effekten av vekstfaktorbehandling over tid.

Konklusjon

Det er et ønske å videreutvikle nye strategier for behandling av mennesker med Parkinsons sykdom. Vi har etablert en dyremodell basert på anerkjente modeller fra litteraturen, og vi bruker denne for å utrede effekten av vekstfaktorer. Forsøkene viser at ikke bare har rottene i løpet av behandlingsperioden fått en bedring i motorisk funksjon, de behandlede rottene har også flere intakte nigrostriatale nervefibrer. Dessuten skjer det celledeling av stamceller og migrasjon av disse mot striatum. Funnene kan tolkes i retning av at infusjon av vekstfaktor ikke bare har symptomatisk, men også nevroprotektiv effekt ved denne dyremodellen. Vekstfaktorer er allerede benyttet i kliniske studier av et begrenset antall pasienter med Parkinsons sykdom i England (12, 13). De som fikk infusjon av vekstfaktoren GDNF, hadde bedret motorisk funksjon selv mange måneder etter at behandlingen var avsluttet. Til tross for lovende resultater er det viktig å studere effekten av vekstfaktorer tilført dyremodeller over tid, ikke minst for å utelukke langsiktige bivirkninger. Av denne grunn er det også av betydning å vurdere muligheten av alternative administrasjonsformer, slik vi har beskrevet i denne artikkelen.

Manuskriptet ble godkjent 17.1. 2006.

Anbefalte artikler