Molekylærbiologisk diagnostikk ved lungekreft

Aage Haugen Om forfatteren
Artikkel

Årlig rammes ca. 2 100 personer av lungekreft i Norge. Forskning viser entydig at røyking er den viktigste årsaken til lungekreft. 85 % av tilfellene anses å være forårsaket av røyking. Andre risikofaktorer kan være passiv røyking i mange år eller det å ha et yrke der man eksponeres for asbest, uran eller annen industriforurensning. Nesten alle pasienter med lungekreft (90 %) dør innen fem år. Best prognose har de pasientene som opereres, men disse utgjør mindre enn 20 % av tilfellene. Selv blant opererte pasienter er residivfrekvensen høy, med femårsoverlevelse på mindre enn 50 %. Behandlingsresultatene ved lungekreft er ikke blitt vesentlig bedre de siste 20 årene. Den dårlige overlevelsen skyldes hovedsakelig at mer enn 2/3 av pasientene har metastaser på diagnosetidspunktet. Det er stort behov for å utvikle bedre diagnostiske og terapeutiske strategier i behandlingen av lungekreft.

Det finnes to hovedgrupper av lungekreft: småcellet (SCLC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Den sistnevnte deles tradisjonelt inn i tre histologiske hovedtyper, plateepitelkarsinom, adenokarsinom og storcellet karsinom. Småcellet lungekreft oppstår fra umodne celler i bronkienes slimhinne. Den vokser meget raskt og sprer seg til andre organer tidlig i sykdomsforløpet. Plateepitelkarsinom oppstår ofte i de store luftveiene, mens adenokarsinom vanligvis er lokalisert perifert. Småcellet lungekreft utgjør ca. 15 – 20 % og ikke-småcellet lungekreft ca. 80 % av tilfellene. Sykdomsutvikling, behandlingsopplegg og prognose er forskjellig for disse fire hovedtypene av lungekreft.

Genetiske forandringer

Kunnskap om molekylære defekter i lungekreftcellen vil kunne være en rettesnor for forløp og prognose. Gjennom de senere års fremskritt innen molekylærbiologi har vi fått økt kjennskap til gener og cellulære prosesser som har betydning for utviklingen av lungekreft. En rekke tumorsuppressorgener er involvert: mutasjoner i TP53 (90 % ved småcellet lungekreft, 50 % ved ikke-småcellet lungekreft), Rb (90 % ved småcellet lungekreft, 15 % ved ikke-småcellet lungekreft), og CDKN2A (p16) (inaktivert i 70 % av tilfellene med ikke-småcellet lungekreft, meget sjeldent ved småcellet) (1). Siden Rb-p16 er komponenter i samme signalvei, vil den biologiske betydningen av en forandring i Rb tilsvare en forandring i p16, de er gjensidig eksklusive. Defekter i p53- og Rb-p16-signalveiene er meget vanlig ved lungekreft. Dette indikerer at disse signalveiene spiller en sentral rolle i regulering av cellevekst, differensiering og apoptose i lungeepitelcellen. Kromosomområdet 3p er studert mye de senere årene, og resultatene viser at dette området innholder flere kandidater til tumorsuppressorgener (FHIT, RASSF1, SEMA3B). LOH i 3p er meget vanlig i lungesvulster (ca. 80 %), men vår forståelse er langt fra komplett med hensyn hvilken biologisk/patogen betydning dette kromosomområdet har. Videre er en rekke andre gener forandret i lungekreftceller, men i mindre grad enn p53 og Rb/CDKN2A: PTEN, SMAD4/TGFβIIR og PPP1R3 (mindre enn 10 %), myc-amplifikasjon forekommer i ca. 10 % av lungekrefttilfellene, mens KRAS-mutasjon forekommer i ca. 30 % av tilfellene med ikke-småcellet lungekreft, hovedsakelig adenokarsinomer. Nylig er det rapportert mutasjoner i EGFR i 8 % (USA) til 40 % (Japan) av adenokarsinomer, særlig blant ikke-røykere (2, 3).

DNA-metylering spiller en viktig rolle i regulering av genuttrykk og representerer en viktig inaktiveringsmekanisme. Den synes å ha like stor betydning for endring i genuttrykk som genetiske forandringer. Genekspresjonen skrus av på grunn av metylering av CpG-områder i promotorregioner. Generelt har svulster global hypometylering, mens promotorområdet er hypermetylert. Mange gener i lungesvulster er vist å være inaktive på grunn av hypermetylering (4) (tab 1). DNA-hypermetylering er også påvist i flere gener tidlig i lungekreftutviklingen som CDKN2A, MGMT, DAPK, RAR-β, FHIT, RASSF1A, og APC.

Tabell 1  Gener som er forandret på grunn av metylering i lungekreft

Cellesyklus

DNA-reparasjon

Apoptose

RAS-veien

Invasjon

CDKN2A

MGMT

DAPK

RASSF1A

E-cadherin

PAX5α

Caspase-8

NORE1A

H-cadherin

PAX5β

FAS

TIMP3

CHFR

TRAILR1

LAMA3

LAMB3

LAMC2

Biomarkører

En av hovedutfordringene de senere årene har vært å utvikle nye metoder for tidlig diagnostikk av lungekreft og å identifisere forandringer som er prediktive for tumorprogresjon.

Sputumprøver vil kunne inneholde kreftceller/premaligne celler og proteiner som er endret selv på et tidlig trinn i utviklingen av lungekreft. Slike prøver er ikke alltid like representative, siden prøvene vil kunne inneholde celler fra ulike områder av respirasjonsveien. Dette bidrar til at sputumcytologi ofte har lav sensitivitet. Bronkioalveolær lavage kan også benyttes til å skaffe biologisk materiale. Dette er mer representativt, fordi man kan ta prøver fra et spesifikt område. Studier har vist at celler som inneholder punktmutasjoner i KRAS og p53, kan detekteres i tidlige stadier av lungekreft. Studier viser at denne testen er mer sensitiv enn sputumcytologi og røntgen thorax. KRAS-mutasjoner ble påvist opptil 18 måneder før den kliniske diagnosen. Imidlertid kan KRAS-mutasjoner også påvises i sputumprøver, selv om svulsten er KRAS-negativ. Dette er ikke overraskende. En påvisning av KRAS-mutasjoner kan skyldes andre primære lungesvulster eller tidlige stadier hos individer med høy risiko for å utvikle lungekreft. Den største ulempen med testen er imidlertid at KRAS-mutasjoner finnes så å si bare i adenokarsinomer, slik at bare en liten del av lungekreftpasientene potensielt vil ha nytte av testen (5).

Med hjelp av en sensitiv polymerasekjedereaksjonsmetode er det påvist avvikende metylering i promotorområdet til CDKN2A og MDMT i sputum hos 100 % av pasientene med plateepitelkarsinom opptil tre år før klinisk diagnose (6). Det er gjennomført flere studier av metylering i genpromotorområdet i sputumprøver fra personer med høy risiko for lungekreft. Det er også gjennomført en oppfølgingsstudie hvor tre blant åtte høyrisikopersoner med hypermetylering i CDKN2A utviklet lungekreft ett år etter innsamlingen av sputumprøven. I en annen studie utviklet 3/5 personer som var positive for RASSF1A-metylering, lungekreft 12 – 14 måneder etter sputumprøven (7). Disse studiene indikerer at bruk av avvikende promotormetylering som molekylær markør kan få stor betydning for diagnostikk av tidlige maligne forandringer og til bruk i screening av høyrisikopersoner.

Flere studier av kreftpasienter har påvist hypermetylering i DNA fra plasma eller serum. En undersøkelse viser hypermetylering i serum blant 50 % av pasienter med lungekreft når promotorregionen i fire gener ble analysert. Man må imidlertid forvente at screening av plasma vil ha lav sensitivitet med hensyn til å påvise premaligne tilstander, siden det må skje en vaskularisering for at DNA skal kunne frigjøres til serum/plasma.

Ved å sammenlikne mikrosatellittendringer i plasma fra pasienter med lungekreft og kontrollpersoner har man funnet at slike endringer korrelerte med klinisk status av pasienten. Ved å benytte revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ble epidermal vekstfaktorreseptor-mRNA påvist i blod fra lungekreftpasienter, men sjelden fra kontrollpersoner. Ekspresjon av andre molekyler, enten kreftspesifikke eller celletypespesifikke gener som CEA, cytokeratin 19, nevromedin B-reseptor er også benyttet til å påvise sirkulerende tumorceller hovedsakelig for prognostisk vurdering.

Forandret proteinekspresjon

Forandret proteinuttrykk, spesielt de som er overuttrykt i svulsten, kan få praktisk anvendelse som diagnostiske tumormarkører. Ulike proteiner er blitt studert, men så langt har ingen proteiner vist seg å være tilstrekkelig prediktive i diagnostikk og prognose. Økt ekspresjon av både epidermal vekstfaktor (EGF) og epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) er påvist i mer enn 60 % av tilfellene med ikke-småcellet lungekreft, noe som indikerer at den signalveien er viktig for denne typen. Småcellet lungekreft er forbundet med økt ekspresjon av nevroendokrine faktorer, som GRP/BN og deres reseptorer. Det tyder på at GRP-reseptors autokrine sløyfe er involvert i veksten av en del tilfeller.

Lungekreft er forbundet med økt ekspresjon i flere sykliner: 12 – 40 % av den ikke-småcellede typen har økt ekspresjon av syklin D1, ca. 20 % er forbundet med høyt nivå av syklin B1. Disse pasientene hadde kortere overlevelse sammenliknet med pasienter der svulstene uttrykte et lavt nivå.

Molekylær klassifisering av lungekreft

Senere års forskning har gitt oss økt kunnskap om genetiske forandringer som leder til de ulike histologiske hovedtypene (fig 1) (8). Fra et diagnostisk synspunkt er det viktig å kartlegge og forstå både de genetiske forandringene som går igjen i alle hovedtypene, og de som er forskjellige mellom de ulike histologiske hovedtypene.

Genetiske forandringer som leder til de ulike histologiske hovedtypene av lungekreft. Figuren er modifisert og gjengitt med tillatelse fra I. Yokota og T. Kohno (8)

Utvikling de senere årene innen mikromatriseteknologien har gjort det mulig å analysere flere tusen gener samtidig. I arbeidet med å identifisere molekylære markører til bruk i kreftklassifisering og prognose har flere grupper analysert genekspresjonsprofiler i lungesvulster (9 – 14). Målsettingen med disse studiene er å identifisere profilene som kan predikere overlevelse og som er til nytte i klinisk diagnostikk. Man regner med at genekspresjonsprofiler vil utkonkurrere dagens kliniske/prognostiske indikatorer. Genekspresjonsprofiler kan bidra til ny klassifisering av lungekreft og behandling basert på molekylær patologi.

Genmarkører er analysert med oligonukleotider og cDNA-mikromatrise. Unike og karakteristiske genekspresjonsprofiler er identifisert for hver av de histologiske hovedtypene av lungekreft (tab 2) (15). Gener som er påvist i mer enn ett datasett, er en rekke cytokeratiner, kollagen VII-α1, galectin 7, p63, det kalsiumbindende proteinet s100A2 og profilin 2. Karakteristisk for plateepitelkarsinom er også gener involvert i cellulære prosesser som detoksifisering og antioksidantproteiner (glutation-S-transferase, karboksylesterase, peroksiredoksin). Polymorfismer i slike gener kan være viktige determinanter for predisposisjon og kan dermed være nyttig informasjon som kan inkorporeres i strategier for forebygging eller screening. Man ser tydelig nevroendokrin differensiering i småcellede karsinomer, hvor flere av genekspresjonsmarkørene er nevroendokrine gener. Mikromatrisestudier viser også overlapp mellom studier for insulinomassosiert gen 1 (IA-1), hASH1 (human achaetescute homolog-1), FOXG1B (forkhead box G1B) og thymosin-β.

Tabell 2  Genekspresjonsprofil og histologi

Småcellet karsinom

Plateepitelkarsinom

Adenokarsinom

GRP

Cytokeratiner

NAP1

DDC

SFN/14 – 3 – 3σ

MUC1

CHGA

p63

TITF1

CHGB

PFN2

FOLR1

CHGC

BPAG1/KIAA0728

SFTPA2

ASCL1

SFTPB

IA-1/INSM1

PTTG1

PGP9.5

UCHL1

Karakteristisk for adenokarsinomer er abnormalt uttrykk av gener som surfaktant A2 og B, mucin 1 og pronapsin A. Dette indikerer at disse tumorene oppstår fra type II-pneumocytter og Clara-celler. Det er nå mulig å dele opp adenokarsinomer i tre kategorier basert på genekspresjonsprofiler. Adenokarsinomer har vist seg å være mer heterogene enn plateepitelkarsinomer og småcellede karsinomer.

Det er gjennomført få studier hvor man har sett på om overlevelse kan predikeres ut fra genekspresjonsprofil. Genekspresjonsprofiler er funnet å ha prognostisk betydning i adenokarsinomer. En kategori som består av svulster som uttrykker nevroendokrine markører som aromatisk aminosyre-dekarboksylase, hASH1 og IA-1, var assosiert med signifikant dårligere overlevelse sammenliknet med andre adenokarsinomer. Det er også utviklet en risikoindeks basert på relativ ekspresjon av visse gener der man kunne identifisere høy- og lavriskogrupper av stadium 1-adenokarsinomer.

Konklusjon

Molekylærbiologiske metoder er på full fart inn i diagnostisk utredning av lungekreft. Kunnskap på det molekylære plan er betydelig, men videre studier er nødvendig innen dette feltet. Det er fortsatt stort behov for å øke vår forståelse av cellulære mekanismer som har betydning for utvikling av lungekreft samt å utvikle bedre diagnostiske og terapeutiske strategier for lungekreft.

Manuskriptet er godkjent 4.5. 2005.

Anbefalte artikler