Kryobiologi – nedfrysing og oppbevaring av levende celler og vev

Sigrid Solberg, Ole Didrik Lærum Om forfatterne

Nedfrysing og opptining av mennesker er omspunnet av mange historier og myter. Det finnes flere eksempler på at folk er blitt funnet livløse ute i kulden og normalt skulle vært ihjelfrosne, men våkner opp etter en stund når de kommer inn i varmen. Sammenblanding av begrepene nedkjøling – hypotermi – og nedfrysing har ført til myten om at pasienter kan fryses ned idet de dør, for siden å bli tint opp når man har funnet en effektiv behandling mot sykdommen de døde av. I filmer som Sleeper, Forever young og Vanilla sky ble det vist hvordan mennesker kan legges på is for senere å tines opp igjen. Det finnes i dag flere firmaer i USA som driver kommersiell nedfrysing av dødssyke mennesker like etter at de trekker sitt siste åndedrag. Det er knyttet sterke økonomiske interesser til kryonisering (cryonics).

Derimot er kryobiologi, læren om programmert nedfrysing og oppbevaring av celler i suspensjon og små vevsbiter, blitt et høyaktuelt emne innen medisinsk forskning og behandling og som har en lang forhistorie (tab 1) (1 – 3). Forbedring av nedfrysings- og oppbevaringsteknikkene har gjort det mulig å kryopreservere et stort spekter av celletyper og organbiter. Utviklingen av fryseteknikker har ikke bare fått store følger særlig for reproduktiv medisin og veterinærmedisin, men også for medisinsk forskning og blodbankvirksomhet

Tabell 1  Viktige fremskritt innen kryobiologi

1776

Spermier fryst ned i snø, gjenvinner sin motilitet etter tining

Spallanzani

1866

Nedfrysing av røde blodceller

Ponchet

1898

Vitrifisering beskrives

Tamman

1938

Spermier gjenvinner motilitet etter å ha vært preservert ved –196  °C eller –70  °C

Jahnel

1948

Svangerskap hos kanin etter lagring av kaninembryo med kryogene teknikker

Chang

1949

Oppdagelsen av at glyseroltilsetting beskytter mot fryseskade

Polge, Smith & Parkes

1953

Første graviditet etter inseminering av spermier oppbevart ved hjelp av kryoteknikk

Bunge & Sherman

1955

Kryopreserverte celler fra milt kan injiseres etter letale strålingsdoser, og gir hematologisk restitusjon hos mus

Barnes & Loutit

1963

Teori om kryogen skade av celler

Mazur

1974

Metode for kontrollert nedfrysing av cornea utvikles. Benyttes kun i kort tid

Sperling

1974

Bruk av ulike krystallhindrende tilsetningsstoffer

Bank & Mauer

1984

Første fødsler etter implantasjon av humant embryo, oppbevart ved hjelp av kryoteknikk

Zeilmaker

1994

Ovarialt vev fra sauer oppbevart ved hjelp av kryogene teknikker, og deretter transplantert med påfølgende svangerskap.

Gosden

Ettersom nye terapiformer utvikles, kan kryobiologi få økende praktisk anvendelse. Derfor ønsket vi å presentere en oversikt over dette feltet for norske lesere. Oversikten er basert på litteraturgjennomgang etter søk i Medline og egne erfaringer (tab 2).

Tabell 2  Noen sentrale begreper

Kryobiologi

Læren om biologiske forhold ved nedfrysing av levende celler og vev

Kryonisering (cryonics)

Fagfeltet nedfrysing av mennesker

Vitrifisering

Rask nedfrysing i høy konsentrasjon av stoffer som hindrer danning av iskrystaller

Programmert nedfrysing

Jevnt temperaturfall, først langsomt, siden raskt i lav konsentrasjon av stoffer som hindrer danning av iskrystaller

Anhydrobiosis

Visse organismers overlevelse av langvarig inntørking. Frysetørring, eller lyofilisering, er utviklet på bakgrunn av dette prinsippet

Biobank

En systematisert samling av celler eller vev

Prinsipper for nedfrysing

Det er hovedsakelig to måter å bringe levende celler til dypfryst tilstand på: vitrifisering og langsom, kontrollert nedfrysing (tab 2). Vitrifisering var allerede i 1930-årene omtalt og antatt som den beste metoden for preservering av celler og vev (4), men ennå har man ikke klart å gjøre metoden effektiv for klinisk eller kommersiell bruk. Standardmetoden som er blitt brukt er derfor langsom, kontrollert nedfrysing (5): Når vannet i en løsning krystalliseres, fryser løsningen. Da alle celler består av om lag 2/3 vann, vil det ved nedfrysing dannes intracellulære iskrystaller, som ødelegger cellene.

Hvis man sørger for tilstrekkelig langsom nedkjøling og god permeabilitet for vann gjennom cellemembranen, forblir det isfritt intracellulært (6). Dersom nedfrysingen skjer for raskt, vil ikke cellen kunne frakte vann hurtig nok ut, og det blir også dannet intracellulære iskrystaller. Økende kjølehastighet gir økt intracellulær isdanning. Ettersom krystallene vokser, fjernes vann fra væskefasen, og konsentrasjonen av elektrolytter og proteiner øker kraftig. Dette utsetter cellene for osmotisk stress, og cellene dehydreres gjennom osmose. På den motsatte siden vil for langsom nedfrysing føre til langvarig eksponering for høye ekstracellulære konsentrasjoner av salter, proteiner og nødvendige tilsetningsstoffer. Både for hurtig og for langsom nedfrysing vil altså kunne skade cellen. Derfor finnes det en optimal nedfrysingshastighet. Dette er hovedprinsippet for den langsomme, kontrollerte nedfrysingen (7) (fig 1). Når cellene er ført til dypfryst tilstand, kan de lagres i et varierende tidsrom, fra bare noen uker ved –20  °C til flere tiår i flytende nitrogen (fig 2).

Prinsippet for programmert nedfrysing: Ved kjøling til frysepunktet avgis varme inntil celler og væske er over i fast fase. Når all væsken er over i fast fase, fortsetter nedkjølingen. Deretter skjer programmert temperaturfall på ca. 1 °C per minutt ned til –20  °C, og siden raskt temperaturfall, dvs. 3 – 4  °C per minutt inntil man når lagringstemperaturen

Figur 2  Frysetank til oppbevaring av levende celler i flytende nitrogen. Foto Gades Institutt

Skade under fryse-/tineprosessen

I prosessen skades cellene av termiske, mekaniske og kjemiske krefter. Krystalldanningen ekstracellulært kan skade cellene på to måter: direkte ved at cellene sprenges, og indirekte ved at is er et dårlig løsningsmiddel, og proteiner, elektrolytter og frysestoffer konsentreres i den gjenværende væsken når det dannes is. For eksempel øker NaCl-konsentrasjonen i en isoton løsning 32 ganger fra 4° til –21 °C (8). Dette vil utsette cellene for osmotisk stress. Ved tilstrekkelig langsom nedfrysing dehydreres cellene ved osmose. Molekyler i cellen med polare deler søker da å danne hydrogenbindinger med andre stoffer enn vann. Dette kan føre til sammenklumping og denaturering av proteiner samt destabilisering av cellemembranen. Dersom det er blitt dannet intracellulær is under nedkjølingen, vil en langsom opptiningsprosess gjøre at iskrystallene vokser og skader cellene ytterligere. Celler som er blitt fryst langsomt ned, har best av å bli tint hurtig opp igjen.

Man forsøker å begrense graden av celleskade ved å tilsette såkalte kryobeskyttende stoffer (5). De skal forhindre skade og øke overlevelse. Deres måte å virke på er ikke fullt klarlagt, men baserer seg på følgende hovedprinsipper:

  1. Beskytte mot potensielt toksisk elektrolyttkonsentrasjon

  2. Redusere effekten av dehydrering

  3. Redusere isdanning

  4. Stoppe frie radikaler

  5. Danne hydrogenbindinger med polare molekyler

  6. Stabilisere cellemembranen

Eksempler på slike stoffer er foruten klassikerne glyserol og dimetylsulfoksid (DMSO), nye og lovende stoffer som katalase, propan-1,2-diol og butan-2,3-diol. Gjennom celleskade som opptrer ved slik nedfrysing, hvor både termiske, mekaniske og kjemiske krefter virker på cellen, kan apoptose aktiveres (9). På den bakgrunnen er det gjort forsøk med å tilsette apoptosehemmere i fryseløsningen for å hindre for stor celledød. Derved overlever flere av cellene. Tilsetting av serum, dvs. makromolekyler, til frysemediet er også med på å beskytte cellene.

Vitrifisering fører til glassaktig solidisering av levende celler ved at viskositeten økes slik at væsken kan gå raskt over i fast fase uten at det dannes iskrystaller (10). Vannet går da over i fast fase sammen med cellene, hvor man fullstendig unngår danning av iskrystaller under kjøling og oppvarming, både intracellulært og ekstracellulært. Anvendelsen er vanskelig på grunn av de potensielt toksiske, høye konsentrasjonene og de spesielt høye nedfrysingshastighetene som er nødvendige. Ved vitrifisering er kjølingshastigheten om lag 400  °C per minutt, mens ved programmert nedfrysing er den på ca. 1 °C per minutt inntil man oppnår fullstendig solid vannfase. Deretter skjer nedfrysingen videre med 3 – 4  °C per minutt inntil lagringstemperaturen.

Praktisk anvendelse

In vitro-fertilisering/reproduksjonsmedisin

Det er særlig innen reproduksjonsmedisinen at fryseteknikkene er blitt optimalisert og fått videst anvendelse (11). Ved in vitro-fertilisering fryser man ned tiloversblitte befruktede egg for senere bruk dersom implantasjon ikke skulle bli vellykket. Dette medfører at alle embryoer teoretisk sett kan bli brukt.

Fryst sæd har vært brukt i stor utstrekning innen veterinærmedisinen. En viss klinisk bruk i Norge skjer ved at sædceller fra pasienter med testikkelkreft blir nedfryst før pasientene får kjemoterapi og bestråling. Det er mange eksempler på normal graviditet med bruk av fryselagret sæd (12, 13).

Ettersom mange cytostatika er beinmargstoksiske, kan høydose cytostatikabehandling ved maligne hematologiske tilstander og solide tumorer føre til dødelig beinmargssvikt. Ved å oppbevare fryste stamceller utenfor organismen mens behandlingen gis, kan cellene tines opp og sprøytes tilbake i pasientene (14).

Nedfrysing av små hudbiter er blitt et viktig verktøy i behandlingen av forbrenninger og i plastisk/rekonstruktiv kirurgi. Sammenliknet med ferske hudtransplantater, kan nedfryste hudbiter lagres i opptil fem år uten signifikant tap av kvalitet. Langerhanske øyer holder seg også viable etter lagring i nitrogen. Lagring av organer ved hjelp av kryoteknikker er imidlertid bare i utviklingsfasen, ettersom størrelse på vevsbiter som kan fryses ned, er begrenset.

Bruk i forskning

Nedfrysing av celler og vevsbiter er blitt et viktig verktøy i eksperimentell medisinsk forskning. Det gjelder ikke minst innen kreftforskningen, der kreftceller av ulike typer og med ulike biologiske egenskaper kan fryses ned og oppbevares levende i 10 – 20 år. Det gjelder også kreftceller fra mennesker, der man i biobanker kan oppbevare store kvanta av levende celler fra pasienter med forskjellige typer sykdommer. Med en slik biobank har man et stort antall ulike kreftceller til rådighet, ofte i mange år etter at pasienten er død av sykdommen.

Verdifulle cellekulturer kan oppbevares nedfryst, slik at man ikke er avhengig av å dyrke dem kontinuerlig i cellekultur. Det samme gjelder en rekke forskjellige transplantable svulster hos forsøksdyr, inklusive kreftsvulster fra mennesker som blir transplantert på immundefekte dyr. Moderne kreftforskning er utenkelig uten bruk av slike fryseteknikker.

Biobanker for stamceller fra navlestrengsblod har fått særlig stor aktualitet etter oppdagelsen av at ulike stamceller har stor grad av plastisitet, og at hemopoetiske stamceller trolig kan medvirke til å danne andre vevstyper, for eksempel hjerneceller, lever- og bindevevsceller. Det er mulig å dyrke stamceller eller vanlige celler i små «støpeformer» av biomaterialer, slik at man får dannet organfragmenter i vevskultur. Dette kan enten brukes direkte eller fryses ned for siden å settes inn i pasienter og remodellere et defekt organ. Fordi stamceller har nesten ubegrenset delingsevne, gir kombinasjonen av disse teknikkene ufattelige muligheter. Derfor tyder alt på at biobanker, cellekultur, stamceller, og kryobiologi i kombinasjon vil bli potente verktøy i behandling av sykdommer i fremtiden. Celle- og vevsterapi kombinert med mikrokirurgi er høyaktuelle nye fagfelter (15).

Forventninger til fremtidig kryopreservering

Fortsatt er det et stort behov for større kunnskap om molekylære mekanismer for celleskade under nedfrysing, ettersom verktøyene man har for lagring av levende celler og vev ligger langt etter den medisinske utviklingen ellers. Mye gjenstår også i overføring fra teori til praktisk klinisk bruk. Samtidig er det behov for større forståelse av fysiokjemiske prosesser som fører til celleskade og mer kunnskap om hvorledes ulike organismer overlever ekstrem kulde eller dehydrering. Foreløpig er ødeleggelse av ekstracellulære strukturer gjennom danning av is hovedproblemet. Effektive metoder for vitrifisering vil derfor kunne løse problemene. Wang og medarbeidere har allerede beskrevet vellykket transplantasjon av ovarier og tuber hos rotter etter bruk av slik fryseteknikk (16), og nye tilsetningsstoffer vil kunne forbedre resultatene ytterligere (17).

Utvikling av frysetørring på bakgrunn av prinsippet for anhydrobiosis kan gi oss en ny og effektiv metode for oppbevaring av levende celler (18). Anhydrobiosis går ut på at organismer som plantefrø, bakterier og sopp kan overleve langvarig inntørking. Metoden har allerede i lang tid vært benyttet i mikrobiologien for oppbevaring av ulike mikrober.

Transplantasjoner er i dag begrenset av tilgangen til friske donerte organer, og av den korte tiden de holder seg levedyktige etter at de er operert ut fra donor. Denne delen av medisinen kunne revolusjoneres dersom organene overlevde nedfrysing. Man kunne da oppbevare organer i påvente av en passende mottaker, i stedet for å la mottaker vente på et passende organ.

For tiden er det store forventninger til klinisk bruk av store biobanker, og ikke minst til forbedring av selve metodene. Hvis størrelsen på vevsbitene som overlevde nedfrysing kunne økes med 10 – 100 ganger, ville dette kunne føre til et stort terapeutisk potensial. Hvis man kombinerer frysepreservering med vevskulturteknikker og biomaterialer, vil man med bruk av intervensjonskirurgi kunne remodellere ødelagte organer i stor stil. Fortrinnsvis bør pasientens egne celler brukes, men også tilbudet på allotransplantasjon ville kunne økes betydelig. Likevel tror vi det er usannsynlig innen overskuelig fremtid at man skal kunne fryse ned hele organer og større kroppsdeler og oppbevare dem levende. Nedfrysing og oppbevaring av hele mennesker er å betrakte som mumifisering og er en useriøs behandlingsmetode.

Oppgitte interessekonflikter: Ingen

1

Polge C, Smith AU, Parkes AS. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures. Nature 1949; 164: 666.

2

Barnes DWH, Loutit JF. The radiation recovery factor: preservation by the Polge-Smith-Parks technique. J Natl Cancer Inst 1955; 15: 901.

3

Rowley S. Hematopoietic stem cell cryopreservation: a review of current techniques. J Hematother 1992; 1: 233 – 50.

4

Luyet B. The vitrification of organic colloids and protoplasm. Biodynamica 1937; 1: 1 – 14.

5

Hubel A. Parameters of cell freezing: implications for the cryopreservation of stem cells. Transfus Med Rev 1997; 11: 224 – 33.

6

Mazur P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. J Gen Physiol 1963; 47: 347 – 69.

7

Pegg DE. The history and principles of cryopreservation. Sem Reprod Med 2002; 20: 5 – 13.

8

Lovelock J. The haemolysis of human red blood cells by freezing and thawing. Biochim Biophys Acta 1953; 10: 414 – 26.

9

Abrahamsen J, Bakken AM, Bruserud Ø et al. Flow cytometric measurement of apoptosis and necrosis in cryopreserved PBPC concentrates from patients with malignant diseases. Bone Marrow Transplant 2002; 92: 165 – 71.

10

Kuleshova LL, Lopata A. Vitrification can be more favourable than slow cooling. Fertil Steril 2002; 78: 449 – 54.

11

Ludwig M, AI-Hasani S, Felberbaum R et al. New aspects of cryopreservation of oocytes and embryos assisted reproduction and future perspectives. Hum Reprod 1999; 14 (suppl 1): 162 – 85.

12

Kliesch S, Kamischke A, Nieschlag E. Cryopreservation of human semen. I: Nieschlag E, Behre HM, red. Andrology: male reproductive health and dysfunction. New York: Springer, 1997: 348 – 56.

13

Jacobsen KD, Fosså SD, Bjøro TP et al. Gonadal function and fertility in patients with bilateral testicular germ cell malignancy. Eur Urol 2002; 42: 229 – 38.

14

Abrahamsen J, Bakken AM, Bruserud Ø. Cryopreserving human peripheral blood progenitor cells with 5-percent rather than 10-percent DMSO results in less apoptosis and necrosis in CD34+cells. Transfusion 2002; 42: 1573 – 80.

15

Palsson B, Hubbel JA, Plonsey R et al. Tissue engineering. Boca Raton: CRP Press, 2003.

16

Wang X, Chen H, Yin H et al. Fertility after intact ovary transplantation. Nature 2002; 415: 385.

17

Zhang X, Li K, Tau KH et al. Trehalose ameliorates the cryopreservation of cord blood in a preclinical system and increases the recovery of CFUx, long-term culture-initiating cells, and nonobese diabetic-SCID repopulating cells. Transfusion 2003; 43: 265 – 72.

18

Wolkers WF, Crowe JH. From anhydrobiosis to freeze-drying of eukaryotic cells. Comp Biochem Physiol 2002; 131: 535 – 43.

Kommentarer

(0)
Denne artikkelen ble publisert for mer enn 12 måneder siden, og vi har derfor stengt for nye kommentarer.

Anbefalte artikler