Kryobiologi – nedfrysing og oppbevaring av levende celler og vev

Oversiktsartikkel
    ()

    sporsmal_grey_rgb
    Abstract
    Bakgrunn.

    Bakgrunn.

    Nedfrysing og oppbevaring av levende celler fra mennesker har en mer enn 300-årig historie. I de senere årene har emnet fått økende aktualitet i medisinen.

    Metoder.

    Metoder.

    Det er to hovedprinsipper for nedfrysing av levende celler og vev: Ved programmert nedfrysing kjøles de ned ved et langsomt temperaturfall, vanligvis 1 °C per minutt. Den andre metoden er vitrifisering hvor celler og væske går over i en glassaktig fast fase gjennom raskt temperaturfall. I begge tilfeller har man tilsatt stoffer som hindrer danning av iskrystaller som ellers vil sprenge cellene.

    Resultater.

    Resultater.

    Celler og vev kan oppbevares ved –70  °C i opptil seks måneder og i mer enn 10 – 15 år ved –196  °C, dvs. i flytende nitrogen. Etter opptining er viabiliteten som regel over 90 %. Slike fryseteknikker har stor anvendelse innen forskning, in vitro-fertilisering, til oppbevaring av stamceller og til transplantasjon. Celler og små vevsbiter fra ulike organer blir oppbevart i forbindelse med behandling av forskjellige sykdommer, alt fra brannskader til artroser. Store biobanker er under oppbygging både til vitenskapelig, diagnostisk og terapeutisk bruk.

    Konklusjon.

    Konklusjon.

    Moderne fryseteknikker er i ferd med å bli viktige hjelpemidler på alle områder av medisinen hvor man bruker celler og mindre vevsbiter. Hele organer eller individer lar seg imidlertid ikke fryse ned i levedyktig stand. Kryonisering (cryonics) der man mot betaling fryser ned hele mennesker, er useriøst og bare en form for mumifisering.

    Abstract

    Background.

    Freeze preservation and prolonged storage of living cells and tissue fragments have been met with increasing interest in medicine during the recent years, for diagnostic, therapeutic as well as research purposes.

    Methods.

    The main methods: Programmed freezing, where a gradual decrease of temperature, usually 1 °C per minute is used, and vitrification: rapid freezing transforms cells and liquids to a solid state. In both cases chemical substances and macromolecules are added to reduce the risk of deleterious crystal formation in water. Such frozen cells can be stored for more than 10 to 15 years and retrieved in a viable condition.

    Results and interpretation.

    At present such techniques are used in reproductive medicine, with storage of human embryos after in vitro fertilization. In addition, there cells are increasing used for other therapeutic purposes, from haemopoietic stem cells to tissue fragments from skin and joint cartilage. Large biobanks of living, frozen cells are now being established in several countries.

    Artikkel

    Nedfrysing og opptining av mennesker er omspunnet av mange historier og myter. Det finnes flere eksempler på at folk er blitt funnet livløse ute i kulden og normalt skulle vært ihjelfrosne, men våkner opp etter en stund når de kommer inn i varmen. Sammenblanding av begrepene nedkjøling – hypotermi – og nedfrysing har ført til myten om at pasienter kan fryses ned idet de dør, for siden å bli tint opp når man har funnet en effektiv behandling mot sykdommen de døde av. I filmer som Sleeper, Forever young og Vanilla sky ble det vist hvordan mennesker kan legges på is for senere å tines opp igjen. Det finnes i dag flere firmaer i USA som driver kommersiell nedfrysing av dødssyke mennesker like etter at de trekker sitt siste åndedrag. Det er knyttet sterke økonomiske interesser til kryonisering (cryonics).

    Derimot er kryobiologi, læren om programmert nedfrysing og oppbevaring av celler i suspensjon og små vevsbiter, blitt et høyaktuelt emne innen medisinsk forskning og behandling og som har en lang forhistorie (tab 1) (1) – (3). Forbedring av nedfrysings- og oppbevaringsteknikkene har gjort det mulig å kryopreservere et stort spekter av celletyper og organbiter. Utviklingen av fryseteknikker har ikke bare fått store følger særlig for reproduktiv medisin og veterinærmedisin, men også for medisinsk forskning og blodbankvirksomhet

    Tabell 1

    Viktige fremskritt innen kryobiologi

    1776

    Spermier fryst ned i snø, gjenvinner sin motilitet etter tining

    Spallanzani

    1866

    Nedfrysing av røde blodceller

    Ponchet

    1898

    Vitrifisering beskrives

    Tamman

    1938

    Spermier gjenvinner motilitet etter å ha vært preservert ved –196  °C eller –70  °C

    Jahnel

    1948

    Svangerskap hos kanin etter lagring av kaninembryo med kryogene teknikker

    Chang

    1949

    Oppdagelsen av at glyseroltilsetting beskytter mot fryseskade

    Polge, Smith & Parkes

    1953

    Første graviditet etter inseminering av spermier oppbevart ved hjelp av kryoteknikk

    Bunge & Sherman

    1955

    Kryopreserverte celler fra milt kan injiseres etter letale strålingsdoser, og gir hematologisk restitusjon hos mus

    Barnes & Loutit

    1963

    Teori om kryogen skade av celler

    Mazur

    1974

    Metode for kontrollert nedfrysing av cornea utvikles. Benyttes kun i kort tid

    Sperling

    1974

    Bruk av ulike krystallhindrende tilsetningsstoffer

    Bank & Mauer

    1984

    Første fødsler etter implantasjon av humant embryo, oppbevart ved hjelp av kryoteknikk

    Zeilmaker

    1994

    Ovarialt vev fra sauer oppbevart ved hjelp av kryogene teknikker, og deretter transplantert med påfølgende svangerskap.

    Gosden

    Ettersom nye terapiformer utvikles, kan kryobiologi få økende praktisk anvendelse. Derfor ønsket vi å presentere en oversikt over dette feltet for norske lesere. Oversikten er basert på litteraturgjennomgang etter søk i Medline og egne erfaringer (tab 2).

    Tabell

    Tabell 2  Noen sentrale begreper

    Kryobiologi

    Læren om biologiske forhold ved nedfrysing av levende celler og vev

    Kryonisering (cryonics)

    Fagfeltet nedfrysing av mennesker

    Vitrifisering

    Rask nedfrysing i høy konsentrasjon av stoffer som hindrer danning av iskrystaller

    Programmert nedfrysing

    Jevnt temperaturfall, først langsomt, siden raskt i lav konsentrasjon av stoffer som hindrer danning av iskrystaller

    Anhydrobiosis

    Visse organismers overlevelse av langvarig inntørking. Frysetørring, eller lyofilisering, er utviklet på bakgrunn av dette prinsippet

    Biobank

    En systematisert samling av celler eller vev

    Prinsipper for nedfrysing

    Prinsipper for nedfrysing

    Det er hovedsakelig to måter å bringe levende celler til dypfryst tilstand på: vitrifisering og langsom, kontrollert nedfrysing (tab 2). Vitrifisering var allerede i 1930-årene omtalt og antatt som den beste metoden for preservering av celler og vev (4), men ennå har man ikke klart å gjøre metoden effektiv for klinisk eller kommersiell bruk. Standardmetoden som er blitt brukt er derfor langsom, kontrollert nedfrysing (5): Når vannet i en løsning krystalliseres, fryser løsningen. Da alle celler består av om lag 2/3 vann, vil det ved nedfrysing dannes intracellulære iskrystaller, som ødelegger cellene.

    Hvis man sørger for tilstrekkelig langsom nedkjøling og god permeabilitet for vann gjennom cellemembranen, forblir det isfritt intracellulært (6). Dersom nedfrysingen skjer for raskt, vil ikke cellen kunne frakte vann hurtig nok ut, og det blir også dannet intracellulære iskrystaller. Økende kjølehastighet gir økt intracellulær isdanning. Ettersom krystallene vokser, fjernes vann fra væskefasen, og konsentrasjonen av elektrolytter og proteiner øker kraftig. Dette utsetter cellene for osmotisk stress, og cellene dehydreres gjennom osmose. På den motsatte siden vil for langsom nedfrysing føre til langvarig eksponering for høye ekstracellulære konsentrasjoner av salter, proteiner og nødvendige tilsetningsstoffer. Både for hurtig og for langsom nedfrysing vil altså kunne skade cellen. Derfor finnes det en optimal nedfrysingshastighet. Dette er hovedprinsippet for den langsomme, kontrollerte nedfrysingen (7) (fig 1). Når cellene er ført til dypfryst tilstand, kan de lagres i et varierende tidsrom, fra bare noen uker ved –20  °C til flere tiår i flytende nitrogen (fig 2).

    Skade under fryse-/tineprosessen

    Skade under fryse-/tineprosessen

    I prosessen skades cellene av termiske, mekaniske og kjemiske krefter. Krystalldanningen ekstracellulært kan skade cellene på to måter: direkte ved at cellene sprenges, og indirekte ved at is er et dårlig løsningsmiddel, og proteiner, elektrolytter og frysestoffer konsentreres i den gjenværende væsken når det dannes is. For eksempel øker NaCl-konsentrasjonen i en isoton løsning 32 ganger fra 4° til –21 °C (8). Dette vil utsette cellene for osmotisk stress. Ved tilstrekkelig langsom nedfrysing dehydreres cellene ved osmose. Molekyler i cellen med polare deler søker da å danne hydrogenbindinger med andre stoffer enn vann. Dette kan føre til sammenklumping og denaturering av proteiner samt destabilisering av cellemembranen. Dersom det er blitt dannet intracellulær is under nedkjølingen, vil en langsom opptiningsprosess gjøre at iskrystallene vokser og skader cellene ytterligere. Celler som er blitt fryst langsomt ned, har best av å bli tint hurtig opp igjen.

    Man forsøker å begrense graden av celleskade ved å tilsette såkalte kryobeskyttende stoffer (5). De skal forhindre skade og øke overlevelse. Deres måte å virke på er ikke fullt klarlagt, men baserer seg på følgende hovedprinsipper:

    • Beskytte mot potensielt toksisk elektrolyttkonsentrasjon

    • Redusere effekten av dehydrering

    • Redusere isdanning

    • Stoppe frie radikaler

    • Danne hydrogenbindinger med polare molekyler

    • Stabilisere cellemembranen

    Eksempler på slike stoffer er foruten klassikerne glyserol og dimetylsulfoksid (DMSO), nye og lovende stoffer som katalase, propan-1,2-diol og butan-2,3-diol. Gjennom celleskade som opptrer ved slik nedfrysing, hvor både termiske, mekaniske og kjemiske krefter virker på cellen, kan apoptose aktiveres (9). På den bakgrunnen er det gjort forsøk med å tilsette apoptosehemmere i fryseløsningen for å hindre for stor celledød. Derved overlever flere av cellene. Tilsetting av serum, dvs. makromolekyler, til frysemediet er også med på å beskytte cellene.

    Vitrifisering fører til glassaktig solidisering av levende celler ved at viskositeten økes slik at væsken kan gå raskt over i fast fase uten at det dannes iskrystaller (10). Vannet går da over i fast fase sammen med cellene, hvor man fullstendig unngår danning av iskrystaller under kjøling og oppvarming, både intracellulært og ekstracellulært. Anvendelsen er vanskelig på grunn av de potensielt toksiske, høye konsentrasjonene og de spesielt høye nedfrysingshastighetene som er nødvendige. Ved vitrifisering er kjølingshastigheten om lag 400  °C per minutt, mens ved programmert nedfrysing er den på ca. 1 °C per minutt inntil man oppnår fullstendig solid vannfase. Deretter skjer nedfrysingen videre med 3 – 4  °C per minutt inntil lagringstemperaturen.

    Praktisk anvendelse

    Praktisk anvendelse

    In vitro-fertilisering/reproduksjonsmedisin

    In vitro-fertilisering/reproduksjonsmedisin

    Det er særlig innen reproduksjonsmedisinen at fryseteknikkene er blitt optimalisert og fått videst anvendelse (11). Ved in vitro-fertilisering fryser man ned tiloversblitte befruktede egg for senere bruk dersom implantasjon ikke skulle bli vellykket. Dette medfører at alle embryoer teoretisk sett kan bli brukt.

    Fryst sæd har vært brukt i stor utstrekning innen veterinærmedisinen. En viss klinisk bruk i Norge skjer ved at sædceller fra pasienter med testikkelkreft blir nedfryst før pasientene får kjemoterapi og bestråling. Det er mange eksempler på normal graviditet med bruk av fryselagret sæd (12, 13).

    Ettersom mange cytostatika er beinmargstoksiske, kan høydose cytostatikabehandling ved maligne hematologiske tilstander og solide tumorer føre til dødelig beinmargssvikt. Ved å oppbevare fryste stamceller utenfor organismen mens behandlingen gis, kan cellene tines opp og sprøytes tilbake i pasientene (14).

    Nedfrysing av små hudbiter er blitt et viktig verktøy i behandlingen av forbrenninger og i plastisk/rekonstruktiv kirurgi. Sammenliknet med ferske hudtransplantater, kan nedfryste hudbiter lagres i opptil fem år uten signifikant tap av kvalitet. Langerhanske øyer holder seg også viable etter lagring i nitrogen. Lagring av organer ved hjelp av kryoteknikker er imidlertid bare i utviklingsfasen, ettersom størrelse på vevsbiter som kan fryses ned, er begrenset.

    Bruk i forskning

    Bruk i forskning

    Nedfrysing av celler og vevsbiter er blitt et viktig verktøy i eksperimentell medisinsk forskning. Det gjelder ikke minst innen kreftforskningen, der kreftceller av ulike typer og med ulike biologiske egenskaper kan fryses ned og oppbevares levende i 10 – 20 år. Det gjelder også kreftceller fra mennesker, der man i biobanker kan oppbevare store kvanta av levende celler fra pasienter med forskjellige typer sykdommer. Med en slik biobank har man et stort antall ulike kreftceller til rådighet, ofte i mange år etter at pasienten er død av sykdommen.

    Verdifulle cellekulturer kan oppbevares nedfryst, slik at man ikke er avhengig av å dyrke dem kontinuerlig i cellekultur. Det samme gjelder en rekke forskjellige transplantable svulster hos forsøksdyr, inklusive kreftsvulster fra mennesker som blir transplantert på immundefekte dyr. Moderne kreftforskning er utenkelig uten bruk av slike fryseteknikker.

    Biobanker for stamceller fra navlestrengsblod har fått særlig stor aktualitet etter oppdagelsen av at ulike stamceller har stor grad av plastisitet, og at hemopoetiske stamceller trolig kan medvirke til å danne andre vevstyper, for eksempel hjerneceller, lever- og bindevevsceller. Det er mulig å dyrke stamceller eller vanlige celler i små «støpeformer» av biomaterialer, slik at man får dannet organfragmenter i vevskultur. Dette kan enten brukes direkte eller fryses ned for siden å settes inn i pasienter og remodellere et defekt organ. Fordi stamceller har nesten ubegrenset delingsevne, gir kombinasjonen av disse teknikkene ufattelige muligheter. Derfor tyder alt på at biobanker, cellekultur, stamceller, og kryobiologi i kombinasjon vil bli potente verktøy i behandling av sykdommer i fremtiden. Celle- og vevsterapi kombinert med mikrokirurgi er høyaktuelle nye fagfelter (15).

    Forventninger til fremtidig kryopreservering

    Forventninger til fremtidig kryopreservering

    Fortsatt er det et stort behov for større kunnskap om molekylære mekanismer for celleskade under nedfrysing, ettersom verktøyene man har for lagring av levende celler og vev ligger langt etter den medisinske utviklingen ellers. Mye gjenstår også i overføring fra teori til praktisk klinisk bruk. Samtidig er det behov for større forståelse av fysiokjemiske prosesser som fører til celleskade og mer kunnskap om hvorledes ulike organismer overlever ekstrem kulde eller dehydrering. Foreløpig er ødeleggelse av ekstracellulære strukturer gjennom danning av is hovedproblemet. Effektive metoder for vitrifisering vil derfor kunne løse problemene. Wang og medarbeidere har allerede beskrevet vellykket transplantasjon av ovarier og tuber hos rotter etter bruk av slik fryseteknikk (16), og nye tilsetningsstoffer vil kunne forbedre resultatene ytterligere (17).

    Utvikling av frysetørring på bakgrunn av prinsippet for anhydrobiosis kan gi oss en ny og effektiv metode for oppbevaring av levende celler (18). Anhydrobiosis går ut på at organismer som plantefrø, bakterier og sopp kan overleve langvarig inntørking. Metoden har allerede i lang tid vært benyttet i mikrobiologien for oppbevaring av ulike mikrober.

    Transplantasjoner er i dag begrenset av tilgangen til friske donerte organer, og av den korte tiden de holder seg levedyktige etter at de er operert ut fra donor. Denne delen av medisinen kunne revolusjoneres dersom organene overlevde nedfrysing. Man kunne da oppbevare organer i påvente av en passende mottaker, i stedet for å la mottaker vente på et passende organ.

    For tiden er det store forventninger til klinisk bruk av store biobanker, og ikke minst til forbedring av selve metodene. Hvis størrelsen på vevsbitene som overlevde nedfrysing kunne økes med 10 – 100 ganger, ville dette kunne føre til et stort terapeutisk potensial. Hvis man kombinerer frysepreservering med vevskulturteknikker og biomaterialer, vil man med bruk av intervensjonskirurgi kunne remodellere ødelagte organer i stor stil. Fortrinnsvis bør pasientens egne celler brukes, men også tilbudet på allotransplantasjon ville kunne økes betydelig. Likevel tror vi det er usannsynlig innen overskuelig fremtid at man skal kunne fryse ned hele organer og større kroppsdeler og oppbevare dem levende. Nedfrysing og oppbevaring av hele mennesker er å betrakte som mumifisering og er en useriøs behandlingsmetode.

    Oppgitte interessekonflikter: Ingen

    PDF
    Skriv ut

    Anbefalte artikler

    Laget av Ramsalt med Ramsalt Media