Farmakologisk påvirkning av den inflammatoriske responsen etter skuddskader hos gris

Yngvar Gundersen, Per Vaagenes, Oddvar Myhre, Jannike Mørch Andersen Om forfatterne
Artikkel

Kvaliteten på akutt behandling av svære traumer er de siste tiårene blitt stadig bedre. Hurtig og effektiv førstehjelp (optimal væsketilførsel og kontroll med respirasjonen på skadestedet, rask transport til sykehus og akutt foreløpig kirurgi) har gjort det mulig å overleve med skader som tidligere var ensbetydende med en sikker død. Mange norske helsearbeidere har fått erfaring i akutt traumebehandling fra konflikt- og katastrofesituasjoner i FN-tjeneste eller i arbeid for humanitære organisasjoner (1 – 3). Innenlands drives det også utstrakt opplæring i effektivt traumemottak (4, 5) og akutt skadebegrensende kirurgi (6).

Selv med optimal og tilsynelatende vellykket primærbehandling vil en urovekkende høy andel av pasientene (opptil 30 %) etter få dager utvikle alvorlig dysfunksjon eller svikt i flere organer (7, 8). En årsak til dette er sviktende balanse mellom den totale vevsdestruksjon og organismens evne til å gjenopprette et normalt «indre miljø». Posttraumatisk systemisk inflammatorisk responssyndrom med flerorgansvikt er en livstruende komplikasjon som krever behandling i intensivavdeling. Men trass i maksimal innsats vil tilstanden ofte langsomt forverre seg og til slutt ende med døden. I dag er dette den viktigste dødsårsak i de senere stadiene etter store skader (9).

Det er vist at nøytrofile granulocytter, som er en vital del av det ikke-spesifikke immunforsvaret, også er sentrale i utviklingen av systemisk inflammatorisk responssyndrom (10). Ved aktivering frigjøres en rekke potensielt toksiske produkter, blant annet frie oksygenradikaler og proteaser. Disse stoffene skiller ikke mellom eget og fremmed vev, og ukontrollert frigjøring kan derfor føre til omfattende skader på proteiner, nukleinsyrer, lipider og andre sentrale biologiske molekyler og strukturer. Den inflammatoriske reaksjonen er normalt avpasset etter størrelsen på det utløsende stimulus, men moderate skader kan «prime» granulocyttene slik at de reagerer ekstra kraftig på en ny ytre påvirkning (second hit) (11). Korrekt akuttbehandling på skadested, under transport og i forbindelse med foreløpig kirurgi er derfor også en nøkkel til å kontrollere det posttraumatiske sykdomsforløpet.

Ved Forsvarets forskningsinstitutt arbeides det med et prosjekt for studier av traumer og blødningssjokk. I en rottemodell har vi vist at en moderat reduksjon av kroppstemperaturen hemmer inflammatorisk overaktivering (12). Men sammen med nødvendig væsketilførsel kan nedkjøling også forsterke ugunstige bivirkninger som blødningstendens og koagulasjonsforstyrrelser (13). Det har derfor vært ønskelig å vurdere alternative behandlingstiltak.

Inflammasjonsreaksjonen kan også påvirkes farmakologisk, eksempelvis med kortikosteroider eller stoffer som griper inn i signaloverføringen i det mitogenaktiverte proteinkinasesystemet (fig 1). Dette kaskadesystemet består av minst tre signalveier: p38, jun-N-terminal kinase (JNK) og ekstracellulær signalregulert proteinkinase (ERK). ERK-veien er kanskje den best karakteriserte, men man vet fremdeles lite om hvordan den mitogenaktiverte proteinkinasen bidrar til den inflammatoriske responsen in vivo.

Forenklet skjema over signaloverføringen i den mitogenaktiverte proteinkinasekaskaden. Systemet består av de tre grenene ERK, JNK og p38. U0126 blokkerer den ekstracellulære signalregulerte proteinkinasen (ERK). Aktivering av kaskaden fører blant annet til at transkripsjonsfaktoren Elk-1 blir aktivert.

Figuren antyder også de tre ulike virkningsmekanismene for steroider: 1) En klassisk mekanisme som påvirker genapparatet, og som dermed har en viss latenstid. 2) En ikke-genomisk reseptoravhengig mekanisme. Via et G-protein hemmer steroidene adenylylcyklasen og dermed omdanningen av ATP til cAMP. Dessuten øker utstrømningen av kalium samtidig som influks av kalsium minker. På denne måten hemmes en rekke kalsiumavhengige prosesser. 3) En ikke-genomisk reseptoruavhengig mekanisme som interfererer direkte med membranfunksjonen. De ikke-genomiske effektene opptrer nesten umiddelbart.

Forkortinger: MEKK – mitogenaktivert proteinkinase kinase kinase; MEK – mitogenaktivert proteinkinase kinase; ERK – ekstracellulær signalregulert proteinkinase, JNK – jun-N-terminal kinase; GR – glukokortikoidreseptor; mGR – membranbundet glukokortikoidreseptor; ATP – adenosintrifosfat; cAMP – syklisk adenosinmonofosfat; HSP – heat shock protein

Hensikten med denne studien var å undersøke hvordan hydrokortison eller ERK-hemmeren U0126 (1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis[2-aminofenyltio]butadien) modulerer den tidlige posttraumatiske produksjonen av frie oksygenradikaler.

Materiale og metoder

Dyremodell

Undersøkelsen ble utført på en etablert grisemodell brukt ved Forsvarets krigskirurgikurs på Lahaugmoen. Etisk godkjenning ble innhentet via veterinærtjenesten i Forsvaret. Til de aktuelle eksperimentene ble det benyttet 17 griser med vekt 45 – 55 kg. Etter ankomst til forsøksområdet la veterinæren dyrene i narkose. De ble oralintubert og spontanventilerte deretter på tuben. Assistert håndventilasjon ble gitt etter behov. Deretter ble det satt lumbosakral epiduralanestesi med lidokain 2 %. Dosen ble beregnet ut fra lengden fra hode til halerot slik at dyrene fikk 1 ml for de først 40 cm og 1,5 ml for hver påfølgende 10 cm (Strandes formel). Venekanyle ble lagt inn i to ørevener for injeksjon av medikamenter og infusjon av væske. Til bruk for trykkmonitorering og blodprøvetaking ble venstre lyskearterie fripreparert og kateterisert med et Secalon-T-sentralvenekateter.

Eksperimentell prosedyre

Dyrene ble i narkose overført til nærliggende skytebane, opphengt i galge og utsatt for et standardisert traume som bestod av ett rifleskudd fra 25 m mot høyre lår, samt ett pistolskudd fra kort hold mot øvre abdomen (fig 2). Skuddretning og profil var avmerket av Forsvarets veterinærer. For å unngå akutt utblødning unngikk man bevisst å skade de store abdominalkarene. Sanitetssoldater gav førstehjelp umiddelbart. Respirasjonen ble kontrollert, sårene pakket og komprimert, og intravenøs væsketilførsel påbegynt. Grisene var på forhånd tilfeldig inndelt i to grupper. Gruppe 1 (n = 9) fikk fem minutter etter siste skudd hydrokortison 250 mg i ørevenen, gruppe 2 (n = 8) tilsvarende mengde fysiologisk saltvann. Dyrene ble deretter transportert til nærliggende feltsykehus for akutt kirurgi. Skadeomfanget ble evaluert ved hjelp av Abbreviated Injury Scale (14). Blodtrykk, temperatur og arteriell oksygenmetning ble kontinuerlig overvåket under operasjonen. Væskebehandling (0,9 % NaCl og dekstran 70/Ringer-acetat) ble gitt etter behov for å kompensere for blødning og opprettholde et akseptabelt blodtrykk. Studien ble avsluttet etter 60 minutter.

Figur 2 Anestesert forsøksgris opphengt i galge. Veterinær har avmerket innskudd på høyre lår og abdomen med kryss. Skuddbanen gjennom øvre del av abdomen er også antydet

Prøvetaking

Blodprøver ble tatt umiddelbart etter at arteriekateteret var på plass (normalprøve, tidspunkt 0), fem minutter etter siste skudd (like før hydrokortison ble gitt) og 60 minutter etter skyting (sluttprøve). EDTA ble brukt som antikoagulans. Prøvene ble straks satt på is og transportert til laboratoriet ved Forsvarets forskningsinstitutt hvor plasma ble separert og nedfryst ved –70 °C. Plasmaverdiene for IL-6 og markører for organskade i lever (ALAT og ASAT) og nyre (kreatinin og karbamid) ble målt ved tidspunkt 60 minutter. Laktat og kortisol i plasma ble bestemt ved tidspunkt 0 og 60, hemoglobin og hematokrit ved 0, 5 og 60.

2,7-diklorofluoroscein (DCF) fluorescens

Syntesen av frie oksygenradikaler ble målt i granulocytter tappet ved tidspunktene 0, 5 og 60 minutter. Granulocyttene ble isolert fra fullblod ved at plasma ble fjernet og erstattet med saltvann. Blandingen ble deretter resuspendert og grandientsentrifugert etter Bøyums metode (15). Målingene ble gjort ved hjelp av den fluorescerende proben 2,7-diklorofluoroscin-diacetat (DCFH-DA), som diffunderer fritt over cellemembranen (16). Intracellulært avspaltes acetatgruppene av esteraser. Det gjenværende 2,7-diklorofluoroscin (DCFH) fluorescerer ikke, men oksideres umiddelbart av frie oksygenradikaler til 2,7-diklorofluoroscein (DCF), som er fluorescerende (530 nm). Fluorescensen fra DCF antas å gjenspeile cellenes generelle oksidative status (17). Målingene ble gjort ved 37 °C i spektrometer hvert andre minutt i 60 minutter. Granulocytter fra ni tilfeldig valgte dyr (fem fra gruppe 1, fire fra gruppe 2) ble testet på samme måte etter behandling med 20 mmol/l U0126.

Statistisk analyse

Resultatene er angitt som middelverdier ± standardfeil. På grunn av stor spredning i produksjonen av frie oksygenradikaler i normalsituasjonen er verdiene angitt som prosentandel av utgangsverdien, som er satt til 100 for hvert enkelt dyr. Vi har brukt paret t-test for å vurdere forskjeller innen gruppene, t-test mellom gruppene. En p-verdi mindre enn 0,05 er ansett som statistisk signifikant.

Resultater

Basalverdier

Det var ingen signifikante forskjeller i utgangsverdiene mellom gruppene (tab 1).

Tabell 1 Utvalgte fysiologiske variabler (gjennomsnitt standardfeil)

Gruppe

Kontroller (n = 8)

Hydrokortison (n = 9)

Kontroller

Hydrokortison

Tid (min)

0

0

60

60

Systolisk blodtrykk (mm Hg)

110,0 ± 2,0

100,0 ± 10,0

  96,0 ± 15,4¹

93,6 ± 6,1¹

SaO₂ (%)

 96,9 ± 0,8

96,3 ± 1,1

87,5 ± 5,6¹

91,8 ± 2,7¹

Hb (g/100 ml)

  10,5 ± 0,2

10,5 ± 0,2

5,1 ± 0,6¹

5,1 ± 0,5¹

Leukocytter (× 10⁹/l)

  17,3 ± 1,0

16,8 ± 1,1

5,4 ± 0,8¹

6,8 ± 0,7¹

Trombocytter (× 10⁹/l)

556 ± 49

589 ± 41

249 ± 39¹

283 ± 33¹

Laktat (mmol/l)

1,8 ± 0,2

2,3 ± 0,4

3,8 ± 0,5¹

4,0 ± 0,6¹

Kortisol (nmol/l)

114,9 ± 17,6

95,3 ± 12,7

  99,2 ± 30,2

 1 934,6 ± 515,21, 2

ASAT, ALAT, karbamid, kreatinin og IL-6 forandret seg ikke fra sine normale utgangsverdier

[i]

[i] ¹  P < 0,05 sammenliknet med utgangspunktet

²  P < 0,05 mellom gruppene

Klinikk og overlevelse

Alle dyrene fikk sammenliknbare skader som ved hjelp av Abbreviated Injury Scale ble vurdert til AIS 2. Samtlige 17 dyr overlevde de første 60 minuttene.

Fysiologiske variabler

Skuddskadene førte til alvorlig blødning med raskt blodtap hos alle dyrene. Hemoglobinverdiene falt raskt; det samme gjaldt verdiene for hvite blodceller og blodplater (tab 1). Systolisk blodtrykk gikk også signifikant ned, men ved hjelp av liberal væsketilførsel ble det stort sett holdt på akseptable nivåer. ASAT og ALAT ble brukt som mål for levercelleintegritet, kreatinin/karbamid for nyrefunksjon. Ingen av disse verdiene beveget seg utenfor normalområdet. Dette gjaldt også IL-6-nivået. Derimot steg laktatverdiene signifikant i begge gruppene.

Fluoroscensspektroskopi

Spontan produksjon av frie oksygenradikaler fra granulocyttene var uforandret etter fem minutter. Etter 60 minutter hadde syntesen i kontrollgrisene økt til 111,6 8,5 % av utgangsverdiene (ikke signifikant), mens tilsvarende tall for hydrokortisongrisene var 78,4 4,9 % (p < 0,05). På dette tidspunktet var det også en statistisk signifikant forskjell mellom gruppene. Behandling med U0126 førte til at produksjonen falt med mer enn to tredeler, uavhengig av tidspunkt eller forutgående behandling med hydrokortison (fig 3).

Diskusjon

Store skader og blødning aktiverer raskt immunkompetente celler, inklusive sirkulerende granulocytter. Dette ble reflektert i tendensen til økt produksjon av frie oksygenradikaler 60 minutter etter skyting. Hydrokortison 250 mg gitt intravenøst kort tid etter traume hemmet syntesen moderat. Den etterfølgende in vitro-behandlingen med U0126 førte til et kraftig fall, uavhengig av tidligere in vivo-aktivering eller behandling med hydrokortison.

Produksjon av frie oksygenradikaler i sirkulerende granulocytter. Søylene til venstre viser hvordan hydrokortison 250 mg, gitt fem minutter etter skade, signifikant hemmer produksjonen av frie oksygenradikaler etter 60 minutter. I kontrollgruppen stiger produksjonen svakt (ikke signifikant). Det er en statistisk signifikant forskjell mellom gruppene. Den kraftige virkningen av påfølgende invitro-behandling med U0126 (20

En rekke studier har vist at både organfunksjon og overlevelse kan bedres ved forbigående å redusere overproduksjon av frie oksygenradikaler etter skade. Moderat hypotermi gir en slik effekt (12). Også kortikosteroider hemmer granulocyttfunksjonen, fortrinnsvis ved å regulere ekspresjonen av gener som styrer produksjonen av inflammatoriske proteiner (18, 19). Virkningen går delvis via transkripsjonsfaktoren NFkB som regulerer transkripsjonen av mRNA til en rekke sentrale substanser i den inflammatoriske kaskaden. Steroidenes virkning blir derfor meget bred, men lite selektiv. At disse medikamentene i tillegg har en akutt ikke-genomisk virkningsmekanisme, er etter hvert blitt overbevisende dokumentert. Det er imidlertid usikkert hvordan den akutte syntesen av frie oksygenradikaler blir påvirket. Dandona og medarbeidere fant for eksempel at hydrokortison gitt til friske forsøkspersoner (100 mg per 60 – 100 kg) maksimalt reduserte produksjonen med 74 % etter to timer. Etter én time var reduksjonen like under 60 % (19). Derimot kunne Toft og medarbeidere ikke finne at forbehandling med metylprednisolon (30 mg/kg) påvirket nivået av frie oksygenradikaler etter større kirurgiske inngrep (kardiopulmonal bypass) (20).

Flere faktorer kan tenkes å medvirke til slike tilsynelatende forvirrende resultater: sammensetning av den undersøkte populasjonen, styrke og standardisering av utløsende stimulus, tidspunkt for behandlingsstart i forhold til traumet, spesiesforskjeller, steroidtype, dose, osv. I den foreliggende studien hadde vi fordelen av å bruke et opplegg som er standardisert gjennom mange år. De to gruppene var svært like med hensyn til sentrale variabler som alder og vekt, skadeomfang, tid fra skade til behandlingsstart, transporttid og behandlingsopplegg fra førstehjelp til akutt kirurgi. Hydrokortison senket produksjonen av frie oksygenradikaler. Mekanistiske studier har vist at steroidene hemmer både fosforylering og translokasjon av p47phox, et nøkkelelement i nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat-oksidasen (21) (fig 4). Våre resultater antyder at effekten er nokså moderat, og det var bare mulig å oppdage signifikante forskjeller ved å bruke relative verdier og la det enkelte dyr fungere som sin egen kontroll.

Modell av nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADPH)-oksidasen i granulocytter. Det membranbundne flavocytokromet b558, som består av gp91phox og p22phox, overfører elektroner fra NADPH til oksygen. G-proteinet Rap1A er kontinuerlig bundet til plasmamembranen og assosiert med b558. p47phox, p67phox og det lille G-proteinet rac2 finnes normalt i cytoplasmaet. Når granulocyttene blir aktivert, translokerer ekvimolare mengder p47phox, 67phox og rac2 til cellemembranen. NADPH er først aktivt når alle disse komponentene er bundet sammen i cellemembranen. Frie oksygenradikaler blir da syntetisert enten ekstracellulært eller inn i et fagosom

Tidspunktet for steroidinjeksjonen i forhold til traumet ser også ut til å spille en avgjørende rolle. Vi målte ingen økt aktivitet i blodprøver tatt fem minutter etter skyting, det vil si like før steroidene ble tilført. Granulocyttene var på dette tidspunktet sannsynligvis bare beskjedent aktivert eller ikke aktivert i det hele tatt. Andre studier har vist at økt oksidativt stress fører til redusert følsomhet for steroider, og senere behandling ville derfor kanskje ha vært mindre effektiv (22).

U0126 virket omgående og kraftig. Produksjonen av frie oksygenradikaler falt med mer enn to tredeler, uavhengig av tidligere aktivering eller behandling med hydrokortison. Laboratorieundersøkelser har antydet at den ekstracellulære signalregulerte proteinkinasen spiller en sentral rolle for å utløse effektorfunksjonene i nøytrofile granulocytter (23). Det er derfor ingen overraskelse at blokade hemmet produksjonen av frie oksygenradikaler, men virkningen var langt sterkere enn antatt. Selv om U0126 skal være meget selektiv, kan uspesifikke effekter ikke utelukkes. Sammenlikningen med hydrokortison blir heller ikke helt rettferdig ettersom U0126 bare ble testet in vitro. Foreløpig finnes det ikke resultater der U0126 er brukt i intakte dyremodeller etter traume, men enkeltrapporter tyder på at den ekstracellulære signalregulerte proteinkinaseveien er sentral for den inflammatoriske responsen også in vivo (24).

Konklusjon

Resultatene antyder at akutt injeksjon av hydrokortison hemmer den umiddelbare inflammatoriske responsen etter store skader. Det samme gjelder kanskje i enda høyere grad den ekstracellulære signalregulerte proteinkinasehemmeren U0126, men fremdeles mangler forsøk med U0126 på intakte dyremodeller.

Fakta
  • Større traumer aktiverer den inflammatoriske responsen

  • Overaktivering kan gi akutte organskader og dessuten disponere for senere flerorgansvikt

  • Tidlig farmakologisk behandling (hydrokortison, U0126) hemmer aktiveringen (målt ved produksjon av frie oksygenradikaler)

Forfatterne takker Forsvarets sjefveterinær, Øystein Os, Forsvarets overlege i kirurgi, Johan Pillgram-Larsen, og Forsvarets overlege i anestesiologi, Knut Ole Sundnes, for bistand og samarbeid.

Anbefalte artikler