Genetiske analyser av Mycobacterium tuberculosis-isolater i Norge 1994 – 98

Ulf R. Dahle, Per Sandven, Einar Heldal, Dominique A. Caugant Om forfatterne
Artikkel

Basert på artikkel publisert i Journal of Clinical Microbiology (13)

I perioden 1994 – 98 utviklet mellom 205 og 244 personer tuberkulose i Norge hvert år. Dette gav en insidens på 4,7 – 5,5 per 100 000 innbyggere. Norge er dermed blant de land i verden som har lavest tuberkuloseinsidens. Det er viktig at denne gunstige situasjonen opprettholdes.

I Norge har vi gjennom mange år hatt en god overvåking av tuberkulose fordi sykdommen er nominativt meldepliktig. Det har også vært drevet et aktivt smitteoppsporingsarbeid i tilknytning til hver enkelt pasient med tuberkulose. I de senere år har vi i tillegg fått en ny, viktig metode for å oppdage smittespredning mellom pasienter, i og med at det er blitt utviklet metoder for differensiering mellom ulike M tuberculosis-isolater. Dette gjøres ved hjelp av DNA-fingeravtrykksanalyser basert på restriksjonsenzym-fragmentlengde-polymorfisme (RFLP) ved hjelp av IS6110 som probe. Denne metoden har vært benyttet på isolater fra mange steder i verden (1 – 10), men i få land har man muligheten til å utføre den på alle isolater. Den gir stabile og reproduserbare resultater og er vel egnet for epidemiologiske studier (5, 10). Noen isolater av M tuberculosis lar seg ikke differensiere tilstrekkelig ved hjelp av RFLP-metoden fordi de har få eller ingen kopier av IS6110. Disse stammene må derfor karakteriseres med andre metoder (f.eks. analyser av en direkte repeterende enhet (DR)) for å klargjøre epidemiologiske sammenhenger.

Dersom to eller flere pasienter er smittet av M tuberculosis-isolat med samme RFLP-mønster, tolkes dette som at smitteoverføring har funnet sted mellom pasientene eller at de har felles smittekilde. Videre benyttes RFLP-analyser til å kvalitetssikre arbeidet med å isolere og dyrke M tuberculosis fra pasientprøver (11). Dersom to eller flere stammer med identisk DNA-mønster mottas fra samme laboratorium innen kort tid og ingen epidemiologiske data knytter pasientene til hverandre, kan det indikere at det foreligger en falskt positiv prøve som følge av laboratorieforurensning.

Målene ved denne undersøkelsen var å fastslå den genetiske diversitet i den populasjon av M tuberculosis som finnes i Norge, for dermed å kunne anslå graden av aktiv smitteoverføring mellom pasienter. I tillegg ønsket vi å trygge kvaliteten på de mikrobiologiske arbeider utført ved å påvise mulige laboratorieforurensninger.

Materiale og metoder

Etter avtale mellom de mikrobiologiske laboratoriene i Norge som utfører dyrking med henblikk på M tuberculosis (13 laboratorier), skal alle isolater sendes til Divisjon for smittevern ved Folkehelseinstituttet for videre undersøkelser. Undersøkelsen omfatter alle isolater mottatt i perioden 1994 – 98. Prøvene ble undersøkt fortløpende. Informasjon om pasientene ble samlet ved Det sentrale tuberkuloseregisteret, Statens helseundersøkelser (nåværende Nasjonalt folkehelseinstitutt).

Identifisering av M tuberculosis var basert på 16S-rDNA-hybridisering (AccuProbe; GenProbe Inc., San Diego, USA) og tradisjonelle mikrobiologiske tester (niacin- og nitrattest).

Kromosomalt DNA ble ekstrahert som beskrevet av Van Soolingen og medarbeidere (12). RFLP-analysene omfattet IS6110-analyser for alle isolater og analyser av en direkte repeterende enhet for de isolater som hadde mindre enn fem kopier av IS6110 (13). IS6110-proben er en 245-bp PCR-amplifisert probe og DR-proben er et syntetisk oligonukleotid på 36 basepar.

DNA ble fragmentert med restriksjonsendonukleasen Pvu II før hybridisering med IS6110-proben og med Alu I før hybridisering med DR-proben. En ekstern markør på 1 kilobase (Boehringer Mannheim, Tyskland) ble benyttet som molekylærvektkontroll. DNA-fragmentene ble separert med elektroforese, blottet over på en membran og hybridisert med den merkede proben (12, 13). IS6110-proben var merket med ”digoxigenin-dUTP labeling and detection kit” (Boehringer Mannheim, Tyskland) og DR-proben var merket med ”enhanced chemiluminescence kit” (ECL, Amersham International plc, Littles Chalfont, Storbritannia). De sekvensene som hadde hybridisert til de merkede probene, ble visualisert som anbefalt av produsentene. Analysene ble utført som beskrevet tidligere (13). En klynge (cluster) ble definert som to eller flere isolater med 100 % identiske RFLP-mønstre.

Resultater

I perioden 1994 – 98 fikk 1 140 pasienter diagnostisert tuberkulose i Norge. Av disse hadde 890 ikke vært diagnostisert med sykdommen tidligere og 783 pasienter var dyrkingspositive. Folkehelseinstituttet mottok isolater fra 92 % av de dyrkingspositive pasientene (13 – 16). Totalt utgjorde dette 816 isolater av M tuberculosis fra 717 forskjellige pasienter. Antallet IS6110-kopier varierte fra null til 19. Gjentatte isolater fra samme pasient var vanligvis identiske (kun ett isolat fra hver pasient ble tatt med i analysene). Det eneste unntaket var en 64 år gammel mann med pakistansk bakgrunn, som fikk tuberkulose to ganger i løpet av perioden. I 1997 ble en M tuberculosis-stamme med unikt RFLP-mønster isolert fra denne pasienten. Ett år senere var han infisert med et isolat som helt manglet IS6110. Det siste isolatet ble funnet i gjentatte prøver. DR-mønsteret til disse to isolatene var også forskjellig, noe som bekreftet at det siste isolatet representerte en eksogen reinfeksjon.

Blant de 718 isolatene ble 20 (2,8 %) antatt å være laboratorieforurensninger. Slik mistanke ble vakt dersom isolater fra to eller flere pasienter hadde identisk RFLP-mønster og prøvene fra disse pasientene hadde vært behandlet på samme laboratorium i løpet av en kort tidsperiode. Dersom det i tillegg ikke fantes noen epidemiologiske data som knyttet pasientene sammen, var det sannsynlig at en prøve hadde kontaminert en eller flere andre prøver. I noen tilfeller var laboratoriet klar over at slik kontaminasjon kunne ha skjedd. Kliniske funn og resultater fra øvrige analyser ble benyttet for å avgjøre hvilken pasient som var smittet i hvert tilfelle. Laboratorieforurensning ble funnet i prøver innsendt fra ni forskjellige laboratorier, og de 20 isolatene ble ekskludert fra analysene.

Etter at de falskt positive isolatene var ekskludert, gjenstod 698 isolater fra 697 patienter. Av disse var 331 (47,5 %) fra pasienter med norsk bakgrunn og 366 (52,5 %) fra innvandrere av første eller annen generasjon. Innvandrerne kom opprinnelig fra Somalia (n = 92), Pakistan (n = 51), Vietnam (n = 40), tidligere Jugoslavia (n = 32), India (n = 17), Filippinene (n = 12), Sri Lanka (n = 11), Etiopia (n = 9), Thailand (n = 8), Kina (n = 6) og 35 andre land (n = 53). For 35 pasienter var opprinnelig nasjonalitet ukjent, men basert på deres navn ble de antatt å være innvandrere. Aldersfordelingen av pasientene er vist i figur 1.

Figur 1   Aldersfordeling av pasienter med norsk bakgrunn (n = 331) og innvandrere (n = 366) med bakteriologisk verifisert tuberkulose i Norge, 1994 – 98

Blant de 698 isolatene fant vi 570 (81,7 %) med unike RFLP-mønstre da resultatene fra IS6110- og DR-analysene ble kombinert. Disse ble antatt å representere enkeltstående tilfeller av tuberkulose som ikke var ervervet fra andre pasienter som inngikk i denne undersøkelsen.

De gjenstående 128 pasientene (18,3 %) var infisert med en M tuberculosis-stamme som også minst én annen pasient hadde. Dette indikerer at transmisjon av M tuberculosis hadde funnet sted mellom disse pasientene eller at smitten var ervervet fra en felles smittekilde. Totalt fant vi 35 slike smittekjeder, og de inkluderte mellom to og 14 pasienter (gjennomsnitt 3,7 pasienter, median to pasienter). Pasientene som var del av slike utbrudd, hadde som regel samme etniske bakgrunn. Av pasientene med norsk bakgrunn som var del av et utbrudd, hadde mange problemer knyttet til alkohol- og/eller narkotikamisbruk eller de hadde familiemedlemmer eller venner med slike problemer.

I tabell 1 finnes informasjon om smittekjedene og de involverte pasientene som ble identifisert i Norge i denne femårsperioden. Det største utbruddet inkluderte 14 pasienter. 11 av disse var av somalisk opprinnelse, to var fra Etiopia og en var en norsk ett år gammel gutt (17). Alle disse isolatene var resistente mot isoniazid og seks var i tillegg resistente mot rifampicin (multiresistent tuberkulose). Det nest største utbruddet var blant en vennekrets i Bergens-regionen som har vært beskrevet tidligere (18).

Tabell 1   Gruppering av Mycobacterium tuberculosis-stammer, isolert fra mer enn én pasient i Norge 1994 – 98, basert på RFLP-mønster. Pasienter med utenlandsk bakgrunn inkluderer første- og annengenerasjons innvandrere

RFLP-analyse

Antall pasienter

Geografisk opphav (alder eller aldersspenn (år)) og kommentarer om pasientene i klyngen

IS6110

14

11 fra Somalia (21 – 35), 2 fra Etiopia (31, 32), 1 fra Norge (1)

IS6110

12

Norge (36 – 86), vennekrets, sosiale problemer, alkoholmisbruk

IS6110 og DR

 9

Vietnam (23 – 49)

IS6110 og DR

 8

4 fra Somalia (2 – 36), 3 fra Norge (36 – 84), 1 fra Etiopia (29)

IS6110

 6

Norge (44 – 83), vennekrets, 1 fikk diagnostisert tuberkulose i 1959, sosiale problemer, alkohol-/narkotikamisbruk

IS6110

 6

Norge (33 – 66), vennekrets, 2 diagnostisert HIV-positive, 1 reist mye i Thailand

IS6110

 4

Norge (74 – 89), 2 fikk diagnostisert tuberkulose i 1939 og 1950

IS6110

 4

Tidligere Jugoslavia (24 – 46), familie

IS6110

 4

Somalia (21 – 33)

IS6110

 4

Norge (39 – 50), sosiale problemer, alkoholmisbruk

IS6110

 4

Norge (45 – 79)

IS6110

 3

Ukjent opphav (27 – 34)

IS6110

 3

India (34), Pakistan (24), ukjent (3)

IS6110

 3

Somalia (19 – 24)

IS6110 og DR

 3

Somalia (16 – 36)

IS6110 og DR

 3

2 fra Sri Lanka (25, 33), 1 fra Pakistan (36)

IS6110

 2

Norge (35, 35), søstre

IS6110

 2

Uganda (36, 52)

IS6110

 2

Tidligere Jugoslavia (22, 34)

IS6110

 2

Norge (80, 81)

IS6110

 2

Norge (73, 84)

IS6110

 2

Norge (44, 51), 1 bekreftet narkotikamisbruker

IS6110

 2

Somalia (13), ukjent opphav (17)

IS6110

 2

Norge (62, 84)

IS6110

 2

Norge (42, 88)

IS6110

 2

Norge (67, 81), tuberkulose diagnostisert i 1930-årene og i 1941

IS6110

 2

Tyrkia (20, 24)

IS6110

 2

Norge (82), Somalia (29)

IS6110

 2

Sri Lanka (43, 54)

IS6110 og DR

 2

1 fra Vietnam (23), 1 fra Thailand (43)

IS6110 og DR

 2

1 fra Somalia (32), 1 fra Etiopia (28)

IS6110 og DR

 2

Vietnam (38), Pakistan (64)

IS6110 og DR

 2

1 fra Somalia (32), 1 fra Vietnam (26)

IS6110 og DR

 2

Somalia (36, 79)

IS6110 og DR

 2

Somalia (26, 27)

Diskusjon

Populasjonen av M tuberculosis som ble analysert i dette arbeidet, var isolert fra pasienter som ble diagnostisert med tuberkulose i Norge i løpet av årene 1994 – 98.

RFLP-analyser av M tuberculosis med bruk av IS6110 som probe er en internasjonalt etablert metode som er godt egnet til å studere epidemiologi og transmisjon av tuberkulose (1 – 10). Metoden er imidlertid dårligere egnet til å skille mellom isolater som har få eller ingen kopier av IS6110. I mange undersøkelser er slike isolater ikke tatt med. Det har imidlertid vært vist at andre metoder, slik som DR-RFLP, kan skille mellom isolater med mindre enn fem kopier av IS6110 (5, 7, 8). I perioden 1994 – 98 hadde 11,5 % av isolatene i Norge mindre enn fem kopier av IS6110. Når DR- og IS6110-mønstrene ble analysert samlet, stemte resultatene godt med de epidemiologiske data knyttet til pasientene (tab 1).

Laboratorieforurensninger er et problem som kan gi alvorlige kliniske konsekvenser. Det ble nylig vist at blant publiserte studier som oppgir dette, varierer andelen falskt positive fra 2,2 % til 10,5 % (gjennomsnitt 3,1 %) (11). I denne undersøkelsen fant vi at 2,8 % av de kulturpositive prøvene i Norge skyldtes laboratorieforurensning. Av de 20 personene som dette gjaldt, var åtte (40 %) blitt behandlet for tuberkulose. I et forsøk på å få bukt med dette problemet diskuteres RFLP-resultatene nå månedlig, slik at det raskt blir tatt kontakt med det aktuelle laboratorium. Ofte er laboratoriene selv klar over slike forurensninger, men i mange tilfeller vil en slik tilbakemelding være viktig. For årene 1999 – 2001 ser det ut til at andelen laboratorieforurensninger i Norge har sunket (resultat ikke vist).

Denne undersøkelsen viste at det var en stor genetisk diversitet blant M tuberculosis-isolater i Norge. På dette grunnlag er det klart at det foregikk lite smitte av tuberkulose. Det største utbruddet inkluderte 14 pasienter, hvor indekspasienten ble identifisert i 1994. Dette utbruddet pågikk fortsatt på slutten av år 2000. Da var i alt 20 pasienter blitt syke, hvorav 11 med multiresistent tuberkulose. Mange av de andre utbruddene som oppstod i midten av 1990-årene, pågikk også i år 2000. Omtrent 10 % av dem som smittes med M tuberculosis, utvikler sykdom i løpet av livet, mange etter flere års latenstid. Dersom de smittede personene ikke identifiseres ved screening av kontakter rundt en pasient, vil disse kunne utvikle sykdom mange år etter at indekspasienten er kurert. Dette er en viktig grunn til at det er vanskelig å stoppe utbrudd av tuberkulose, selv i et land som Norge, med lav insidens, god nasjonal overvåking og effektiv behandling.

Den lave andel av transmisjon i Norge var forskjellig fra situasjonen i Danmark. Der var 49 % av dyrkingspositive pasienter i 1992 – 96 del av en smittekjede (1). Denne store forskjellen skyldtes hovedsakelig at det oppstod to store utbrudd, med henholdsvis 110 og 90 pasienter, i Danmark i denne perioden. Transmisjon av M tuberculosis er også høyere i mange andre land enn i Norge (2, 4, 7 – 10). Kun to undersøkelser har rapportert så lave tall som denne norske undersøkelsen. Omtrent 15 % av pasientene i Pisa, Italia (3), og 17,5 % av pasientene i Zürich, Sveits (6), var del av en klynge.

De fleste av M tuberculosis-isolatene fra innvandrere hadde unike RFLP-mønstre, og bare 19,7 % var del av en klynge. Dette viser at også blant innvandrere skyldes tuberkulose som regel reaktivering av tidligere infeksjon, sannsynligvis før ankomst til Norge. Tuberkulosekontroll ved ankomst til Norge av innvandrere og andre personer som har oppholdt seg lenge i land med høy forekomst av sykdommen, er derfor et svært viktig tiltak for å redusere forekomsten i Norge. Det var i perioden 1994 – 98 ikke vanlig at transmisjon fant sted på tvers av etniske grupper. Bare unntaksvis smittet innvandrere nordmenn eller vice versa. Dette var ulikt situasjonen i Nederland, der omtrent halvparten av smitten til etniske nederlendere kom fra innvandrere (2).

I Norge er det mulig å drive detaljert nasjonal overvåking av tuberkulose, da vi har en liten populasjon og lav insidens av sykdommen. Denne undersøkelsen bekrefter tidligere funn at aktiv transmisjon av tuberkulose er lav her i landet (19). Relativt få pasienter, både etniske nordmenn og innvandrere, så ut til å være nylig smittet i Norge.

Vi takker de mikrobiologiske laboratorier i Norge for innsendelse av isolater til Folkehelseinstituttet. Takk også til Berit Gregussen, Anne M. Klem, Elisabet Rønnhild, Solveig Undseth og Ingun Ytterhaug for teknisk assistanse og Nanne Brattås og Vigdis Dahl for hjelp med datainnsamling. Videre vil vi takke American Society for Microbiology for velvillig tillatelse til å publisere dette arbeidet i Tidsskriftet.

Anbefalte artikler