Molekylærgenetisk diagnostikk av Charcot-Marie-Tooths sykdom og hereditær nevropati med trykkpareser

Nina K. Aarskog, Christian A. Vedeler Om forfatterne
Artikkel

Charcot-Marie-Tooths sykdom (CMT) er blant de vanligste arvelige nevrologiske tilstander, med en estimert prevalens på en av 2 500 (1). Den ble beskrevet første gang i 1886 av franskmennene Charcot og Marie og engelskmannen Tooth som en arvelig form for peroneal muskelatrofi. Senere ble det imidlertid vist at dette er en sykdom i det perifere nervesystem, og i dag utgjør den en heterogen gruppe av hereditær motorisk og sensorisk nevropati (HMSN). Arvegangen ved Charcot-Marie-Tooths sykdom er oftest autosomalt dominant, men kan være autosomalt recessiv, X-bundet eller forekomme som sporadiske ikke-familiære tilfeller.

Basert på nevrofysiologiske og nevropatologiske studier er Charcot-Marie-Tooths sykdom delt opp i to store hovedgrupper: Charcot-Marie-Tooth type 1 (CMT1) og Charcot-Marie-Tooth type 2 (CMT2) (2 – 4). Ved CMT1, som er den demyeliniserende formen, finnes redusert nerveledningshastighet, demyelinisering og karakteristiske løkformasjoner (onion bulbs) i nervebiopsi. Ved CMT2, som er den aksonale formen, er nerveledningshastigheten tilnærmet normal, men med redusert amplitude, ellers ingen myelinaffeksjon i nervebiopsi. Ved CMT1 blir det etter hvert sekundær aksonal affeksjon, som medfører langsom forverring på linje med det man ser ved CMT2 (5, 6). CMT1 og CMT2 viser som regel et sammenfallende klinisk bilde med symmetrisk distal affeksjon av både motoriske og sensoriske nervefibrer.

Nyere genetisk kunnskap om Charcot-Marie-Tooths sykdom har resultert i en rekke ulike undergrupper, og dette gjør klassifikasjon av kliniske fenotyper mindre oversiktlig. Sykdommen er koblet til mer enn 30 ulike genloci og skyldes mutasjoner i ett av til nå ni ulike identifiserte gener (http://molgen-www.uia.ac.be/CMTmutations/) (tab 1). Disse genene koder for proteiner med forskjellige funksjoner som er viktig for myelindanning, struktur og integritet av Schwannske celler. CMT2 er koblet til fire forskjellige genloci, men så langt er kun to gener identifisert (7) (tab 1).

Tabell 1   Gendefekter ved Charcot-Marie-Tooths sykdom (CMT) og hereditær nevropati med trykkpareser (HNPP). AD = autosomalt dominant; AR = autosomalt recessiv; XLD = X-bundet dominant; PMP22 = perifert myelinprotein 22-gen; MPZ (P0) = myelinprotein 0-gen; ERG2 = tidlig vekst-responsgen 2; KIF1B β = kinesin familiegen; NF-L = nevrofilament lett-gen; MTMR2 = myotubularin-relatert protein 2-gen; NDRG1 = N-myc nedstrømsregulert gen-1; PRX = periaxin-gen; Cx32 = connexin 32-gen

CMT

CMT (%)

CMT-subgruppe

Arv

CMT-subgruppe (%)

Gen

Locus

Mutasjon

Funksjon

CMT1

50

CMT1A

AD

70 – 80

PMP22

17p11.2-12

Duplikasjon

Myelinstruktur/veksthemmer

AD¹

Sjelden

PMP22

17p11.2-12

Mutasjon

Myelinstruktur/veksthemmer

CMT1B

AD¹

5 – 10

MPZ

1q22-q23

Mutasjon

Myelinstruktur/adhesjonsprotein

CMT1C

AD

10 – 15

CMT1D

< 5

ERG2

10q21-q22

Mutasjon

Myelinstruktur/celledeling

CMT2

20 – 40

CMT2A

AD

Ukjent

KIF1B β

1p36

Mutasjon

Transportprotein

CMT2E

AD

Ukjent

NF-L

8p21

Mutasjon

Nevrofilamentorganisering/regulering

CMT4

Sjelden

CMT4B

AR

Ukjent

MTMR2

11q23

Mutasjon

Myelinstruktur/celledeling

CMT4D

AR

Ukjent

NDRG1

8q24

Mutasjon

Veksthemmer/celledifferensiering

CMT4E

AR

Ukjent

ERG2

10q21-q22

Mutasjon

Myelinstruktur/celledeling

CMT4F

AR

Ukjent

PRX

19q13

Mutasjon

Myelinstruktur

CMTX

10 – 20

CMTX

XLD

90

Cx32

Xq13-q21

Mutasjon

Proteintransport

HNPP

HNPP

AD

70 – 80

PMP22

17p11.2-12

Delesjon

Myelinstruktur/veksthemmer

HNPP

20 – 30

PMP22

17p11.2-12

Mutasjon

Myelinstruktur/veksthemmer

  • Sjeldne recessive former for Charcot-Marie-Tooths sykdom med mutasjon i PMP22- eller P0-genet forekommer også

Hereditær nevropati med trykkpareser (HNPP) er oftest karakterisert ved forbigående episoder av nummenhet og lammelser som følge av relativt lette kompresjoner eller traumer av perifere nerver. Sykdommen er nylig omtalt i Tidsskriftet (8). Nevrofysiologiske og patologiske studier viser redusert nerveledningshastighet og demyelinisering med fokale fortykninger i myelin, kalt ”tomaculi” (4, 9).

Gendose som mekanisme for CMT1A og hereditær nevropati med trykkpareser

Mer enn halvparten av tilfellene av Charcot-Marie-Tooths sykdom forekommer som CMT1, og ca. 80 % av disse utgjøres av CMT1A (10). CMT1A skyldes en molekylær duplikasjon på 1,5 megabaser (Mb) (1,5 millioner basepar) på kromosom 17 i området p11.2-12. Denne regionen inneholder genet som koder for perifert myelinprotein 22 (PMP22), og en duplikasjon av genet PMP22 er således årsak til de fleste tilfellene av sykdommen (4, 7, 9, 11). Komplementært til duplikasjon på kromosom 17p11.2-12 er en delesjon av det samme 1,5 Mb-området som fører til hereditær nevropati med trykkpareser (4, 9).

PMP22, som ligger i den dupliserte/deleterte 1,5 Mb-regionen, medfører at pasienter med CMT1A har tre kopier av genet PMP22 (ett duplisert kromosom med to genkopier og ett normalt kromosom med én genkopi), mens en delesjon medfører at individer med hereditær nevropati med trykkpareser bare har én kopi av genet for PMP22 (ett deletert kromosom uten genkopi og ett normalt kromosom med e…n genkopi).

Hvordan duplikasjon og delesjon av genet for PMP22 forårsaker de respektive kliniske fenotyper, CMT1A og hereditær nevropati med trykkpareser, er ikke fullstendig kartlagt. Imidlertid viser studier basert på morfologiske fenotyper av perifere nerver hos naturlige mutanter og transgene gnagere at PMP22-protein er involvert i initieringsfasen av myelinisering og opprettholdelse av myelin- og nevrogliainteraksjoner (5). Det er sannsynlig at PMP22 er et dosesensitivt gen, idet kvantitative målinger av både PMP22-mRNA og -protein i nervebiopsier fra CMT1A- og HNPP-pasienter viser henholdsvis økt eller redusert nivå (9, 11). Selv små endringer i nivået av PMP22-protein forstyrrer stabiliteten i kompakt myelin-struktur og proteinsammensetning, noe som fører til dysmyelinisering (5).

En minoritet av CMT1-pasienter med dominant arvelig CMT1A uten duplikasjon kan ha mutasjoner i PMP22-genet (tab 1). En mindre vanlig form for CMT1, CMT1B (5 – 10 %) skyldes mutasjon i myelinproteinnullgenet (MPZ, P0), lokalisert til 1q21-23 (CMT1B). En sjelden årsak til CMT1, CMT1D (<5 %) er mutasjoner i genet EGR-2 ( krox 20), som koder for en sinkfingertranskripsjonsfaktor som er uttrykt i myeliniserende schwannske celler. Den X-bundne formen for Charcot-Marie-Tooths sykdom, CMTX (10 – 20 %) likner klinisk på CMT1 og skyldes mutasjoner i connexin 32-genet på Xq12-13 (10, 12). Connexin 32 er et kanalprotein som finnes i en rekke celler, deriblant schwannske celler, men det er ikke inkorperert i kompakt myelin (11). De ulike mutasjonene forstyrrer myelinisering og schwannske cellers funksjon på flere komplekse måter, og fører dermed til ulike kliniske fenotyper (5).

Diagnostikk av CMT1A-duplikasjon og HNPP-delesjon

På grunn av relativt høy prevalens av CMT1A-duplikasjon og HNPP-delesjon hos pasienter med arvelig eller sporadisk polynevropati er molekylærgenetisk diagnostisk test av disse gendefektene av stor diagnostisk verdi. CMT1A/HNPP har til nå vært diagnostisert på basis av ulike molekylærgenetiske metoder, som alle har sine fordeler og ulemper.

  • – Southern blot-teknikk (13) kan benyttes for påvisning av doseforskjeller til restriksjons enzym-fragmentlengde-polymorfe (RFLP) alleler (14). Denne metoden kan kombineres med kvantitativ fotostimulert bildebehandling (PSL imaging) for en mer nøyaktig kvantitativ diskriminering av alleldoseforskjeller (15). Metoden er tidkrevende (4 – 5 dager), men har relativt høy sensitivitet.

  • – Pulsfelt gelelektoforese (PFGE) (13, 14) kan benyttes for å identifisere et nytt RFLP-allelbånd som et resultat av 1,5 Mb-duplikasjon/-delesjon (15). Metoden er svært tidkrevende (7 – 8 dager), men har høy sensitivitet.

  • – Fragmentanalyse er basert på mikrosatellittmarkører (short tandem repeat – STR) i dupliserte/deleterte 1,5Mb-regioner (14, 15). Metoden er relativ rask (to dager), men har begrenset sensitivitet.

  • – Fluorescens in situ-hybridisering (FISH) (13) detekterer den dupliserte/deleterte regionen på kromosomer i interfase ved hjelp av fluorescensmerkede prober (14). Metoden er tidkrevende (fire dager), men regnes for å ha høy sensitivitet.

  • – REP (repeat)-PCR kan identifisere områder for duplikasjon/delesjon (16 – 18). Dette er en relativt rask metode (en dag), men den har begrenset sensitiviteet.

  • – Sluttid (end-point) kvantitativ PCR har også vært benyttet for PMP22. Ved denne metoden beregnes den totale mengde PCR-produkt produsert av normal kontrollperson i en reaksjon i forhold til pasient med duplikasjon/delesjon (19). Metoden er rask, men sensitiviteten er usikker.

  • – Sanntid (real-time) kvantitativ PCR (fig 1)-basert deteksjon av CMT1A-duplikasjon og HNPP-delesjon er en ny metode som vi har utviklet (20) (fig 2). Sanntid-PCR benytter seg av standard PCR-metodikk sammen med en fluorescent TaqMan-metodikk (21, 22) og en ”ABI Prism 7700” sekvensdetektor. Ved denne metoden kvantiteres alle nyproduserte PCR-produkter for hver nye PCR-syklus i totalt 40 PCR-sykluser. Dette gjør det mulig å måle progresjon av PCR-reaksjoner underveis (real-time), og metoden har revolusjonert PCR-basert kvantitering av DNA og RNA. For å beregne tre genkopier PMP22 ved CMT1A-duplikasjon og en genkopi PMP22 ved HNPP-delesjon benyttet vi oss av en komparativ Ct beregningsmetode ( DD CT) (23). Basert på studier av norske CMT1A- og HNPP-pasienter har vi kunnet definere verdier som gir et uttrykk for antall PMP22-genkopier ved CMT1A-duplikasjon ( DD Ct> 1,50) og HNPP-delesjon ( DD Ct< 0,60) i tillegg til normale (0,82< DD Ct> 1,30) (20).

Figur 1   Ved sanntid (real-time) kvantitativ PCR (ABI Prism Sequence Detector 7700) er det festet en TaqMan-probe i området mellom øvre og nedre primer. To forskjellige fluorescensfarger, en signalgiver (reporter-R) og en undertrykker (quencher-Q), er festet til 5”- og 3”-enden av proben. Når begge fargene er festet til proben, vil emisjon fra R undertrykkes av Q. Under PCR-ekstensjonsfasen hydrolyserer Taq-DNA-polymerase R-fargen fra proben. Frigjøring av R fra Q medfører en økning i emisjonsspekteret. Mengde fluorescens detekteres for hver ny PCR-syklus av totalt 40 og er proporsjonal med mengde akkumulert PCR-produkt (figur modifisert fra Applied Biosystems)

Figur 2   Sanntid (real-time) kvantitativ PCR-amplifikasjonsplot av genet PMP22 mot albumin som referansegen. A) normal kontrollperson, B) pasient med CMT1A-duplikasjon og C) pasient med HNPP-delesjon. A) viser total mengde fluorescert probe degradert for hver ny PCR-syklus, reflektert ved verdien D Rn på y-aksen, og utgjør en eksponentiell vekstkurve. Tid representert som antall PCR-sykluser plottes på x-aksen. Når tilfredsstillende mengde hybridisert probe er spaltet av Taq-DNA-polymerase, vil intensitet til signalgiver (reporter-R) fluorescert emisjon øke. Ved terskelsyklus Ct (treshold cycle) vil kurven krysse en verdi som er beregnet ut fra fluorescert bakgrunnsnivå for alle PCR-reaksjonene. På denne måten kan total mengde PCR-produkt kvantiteres ved et tidlig tidspunkt av den eksponentielle vekstfasen for en PCR-reaksjon. Jo høyere antall DNA-startkopier, desto raskere vil man observere en signifikant økning i fluorescens ved at man når den eksponentielle vekstfasen for PCR-reaksjonen tidligere og dermed oppnår en lavere terskelsyklusverdi Ct. B) Som vist vil CMT1A-duplikasjon øke antall genkopier for PMP22 fra to til tre og føre til redusert Ct-verdi i forhold til albumin med to genkopier. C) Tilsvarende vil HNPP-delesjon, hvor genkopiantallet for PMP22 er redusert fra to til ett, medføre en høyere Ct-verdi enn for albumin. Ved punktet Ct vil heller ingen av reaksjonskomponentene i PCR-reaksjonen være begrensende, og dette gjør Ct-verdiene svært reproduserbare og forbedrer betraktelig presisjonen for DNA-kvantitering. Endringene i Ct-verdi gir grunnlag for å bruke en komparativ Ct-metode for å identifisere antall genkop

ier (20)

Metoden er rask (to timers analyse, 13 pasienter), krever et minimum av DNA, er enkel og involverer ikke bruk av radioaktivt arbeid eller etterbehandling av PCR-produkt. Vi har funnet at denne metoden har høy sensitivitet og er mer sensitiv enn både PSL-imaging (15) og REP-PCR (18).

Diskusjon

Det er klinisk mistanke om Charcot-Marie-Tooths sykdom hvis det foreligger en langsomt progredierende symmetrisk polynevropati som opptrer i løpet av de tre første decennier, sammen med en positiv familiehistorie. Oftest er det de motoriske symptomer som dominerer, men den nevrologiske undersøkelsen er forenlig med både sensorisk og motorisk polynevropati. De typiske funn er distal atrofi, mest uttalt i beina, med hulfot og hammertær, distale pareser, arefleksi og distal sensibilitetsreduksjon av overflatiske og dype sansekvaliteter. Ved klinisk undersøkelse kan det være vanskelig å skille CMT1, CMT2 og CMTX, men nerveledningshastigheten er sterkt redusert ved CMT1 (ofte< 30 m/s for motoriske nerver i beina). Ved CMTX kan det forekomme forlenget sentral konduksjonstid ved auditivt fremkalt hjernestammerespons, som uttrykk for at connexin 32 også finnes i sentralnervesystemet (24). Déjerine-Sottas sykdom (tidligere CMT3) betraktes nå som en alvorlig variant av CMT1A, CMT1B eller CMT4. CMT3 er derfor foreslått å være forbeholdt autosomalt recessive aksonale nevropatier (7). Hereditær nevropati med trykkpareser opptrer som regel med residiverende kompresjonsnevropatier i samme familie, og de kliniske funn er forenlig med motorisk og sensorisk mononevropati (8). Imidlertid kan det være overlappende symptomer og funn med Charcot-Marie-Tooths sykdom, og det er ved hereditær nevropati med trykkpareser også en stor grad av fenotypisk variasjon.

Familiehistorie med affiserte individer over tre generasjoner med klare nevrologiske funn som angitt ovenfor tyder på Charcot-Marie-Tooths sykdom/hereditær nevropati med trykkpareser. Slike pasienter kan imidlertid ha negativ familiehistorie fordi mildt uttrykte former i familier ikke er diagnostisert, på grunn av recessiv arvegang, usikkert farskap eller pasienten kan ha en ny mutasjon.

Når det gjelder den genetiske diagnostikk, vil det i familier med tilsynelatende dominant arv og redusert nervelednings-hastighet være naturlig først å teste på CMT1A (duplikasjon av genet for PMP22). Dersom denne testen er negativ, bør den etterfølges av en CMT1B-test (mutasjonsanalyse av genet for P0). I familier med tilsynelatende X-bundet arv bør mutasjonsanalyse av connexin 32-genet utføres. Negative resultater basert på slik testing kan imidlertid ikke utelukke diagnosen, siden Charcot-Marie-Tooths sykdom kan skyldes mutasjoner i PMP22-genet, andre relaterte gener, hittil ukjente gener eller eventuelt en annen form for hereditær nevropati med kliniske likhetstrekk. Ved hereditær nevropati med trykkpareser vil de fleste pasientene ha delesjon av genet for PMP22. De genetiske testene som er nevnt ovenfor, vil påvise enten duplikasjon eller delesjon i samme prøve. Mutasjonsanalyser gjøres ikke rutinemessig for CMT2 eller CMT4.

Vi har funnet at sanntid (real-time) kvantitativ PCR er meget rask og sensitiv for påvisning av CMT1A-duplikasjon og HNPP-delesjon, og denne metoden er derfor vårt førstevalg ved supplerende utredning av disse typer av arvelig polynevropati. Vi tar sikte på at analysen etter hvert skal inngå i det generelle laboratoriediagnostiske tilbudet ved Senter for medisinsk genetikk og molekylærmedisin, Haukeland Sykehus. I vår egen forskningsgruppe vil vi nå starte med mutasjonsanalyser for CMT1A, CMT1B og CMTX for de pasienter hvor CMT1A-duplikasjon ikke kan påvises.

Studiene er støttet av Gerda Meyer Nyquist Gulbranson og Gert Meyer Nyquists forskningsfond.

Anbefalte artikler