Addendum
Bakgrunn. Ved elektronmikroskopi benyttes elektroner i stedet for synlig lys for å avbilde objektet. Elektronstrømmens bølgelengde er mye mindre enn den som karakteriserer synlig lys (ved de spenninger som genereres i elektronmikroskopet i størrelsesorden 1/100 000 av denne). Da et mikroskops oppløsningsevne er tilnærmet omvendt proporsjonal med bølgelengden i strålingen fra lyskilden, kan man ved hjelp av elektronmikroskopet oppnå en langt større oppløsning enn i lysmikroskopet.
Elektronstråler kan avbøyes i elektromagnetiske felter. Etter at de første elektronlinser ble konstruert, omkring 1930, ble det første elektronmikroskopet bygd i løpet av 1930-årene i Tyskland (21).
Oppbyggingen av elektronmikroskopet er skjematisk angitt i figur 3. De negativt ladede elektronene avgis ved oppvarming av en elektronkilde, oftest et wolframfilament, og akselereres mot en positivt ladet anodeplate. Elektronstrålen fortsetter deretter nedover i lumen av en metallsøyle som kontinuerlig evakueres for luft for å opprettholde høygradig vakuum. Strålen passerer en serie med elektromagnetiske linser, hvorav den første er kondensorlinsen, som sørger for at preparatet bestråles. Fordi elektroner bremses eller avbøyes når strålen når molekylært tette deler av preparatet, dannes en avbildning av preparatet, som i sin tur fokuseres og forstørres ved passasjen gjennom de påfølgende sett av linser. Elektronstrålen når til slutt en fluorescerende skjerm, hvor lyspartikler, fotoner, emitteres slik at man får en visuell fremstilling av preparatet. Ved å vippe opp den fluorescerende skjermen oppnår man at elektronstrålen treffer en fotografisk plate. På denne fremkommer et negativt bilde av objektet, en positiv kopi fremstilles deretter på vanlig fotografisk papir (22, 23). Det er nå tilgjengelig systemer for digital fotografering og lagring av elektronmikroskopiske bilder, som forventes å bli en standardmetode i fremtiden.
Preparering av vev. For at en vevsbestanddel skal kunne undersøkes i elektronmikroskopet, må den forbehandles slik at den kan skjæres i ultratynne snitt samtidig som vevets morfologi er tilfredsstillende bevart. Det første trinn i denne prosessen er fikseringen av vevet. Et velegnet primærfiksativ er glutaraldehyd i 2 % løsning i natrium cacodylatbuffer med pH 7,3 – 7,4. Glutaraldehyd reagerer svært raskt med proteiner og stabiliserer strukturmolekyler ved hjelp av kryssbindinger. Penetrasjonshastigheten er på den annen side mindre enn f.eks. for formalin, hvilket innebærer at vevsbitene må være meget små, dvs. ideelt ikke mer enn 1 – 4 mm 3 . Nålebiopsier er meget velegnede. Noen benytter et fikseringsmiddel bestående av 4 % formaldehyd og 1 % glutaraldehyd (McDowells væske).
Da glutaraldehyd ikke i tilstrekkelig grad stabiliserer umettet fett eller fosfolipider, anvendes i tillegg osmiumtetroksid som et sekundært fiksativ. Dette fikserer lipidene og reduserer dermed risikoen for senere ekstraksjon av disse vevskomponentene. I tillegg gir osmiumtetroksid en høy grad av kontrast til enkelte, såkalte osmiofile strukturer i cellen eller vevet (24).
Som innstøpningsmedium anvendes oftest en epoksyresin, som muliggjør skjæring av ultratynne snitt. Før innstøpningen gjennomgår vevet dehydrering ved hjelp av etanol eller aceton i stigende konsentrasjoner. Deretter infiltreres vevet med aceton tilblandet økende konsentrasjoner av innstøpningsmediet frem til et siste infiltrasjonstrinn i ren epoksyresin. Etter tilsetting av herder polymeriseres epoksyresinet over natten ved 60 ˚C i en herdingsovn. Semitynne snitt (ca. 1 µ m) skjæres med en glasskniv på en spesiell type mikrotom, en såkalt pyramitom. Disse snittene farges med toluidinblått (kalles ofte blåsnitt) og studeres i et lysmikroskop for at man skal kunne identifisere de områder som er best egnet for videre skjæring av ultratynne snitt. Disse skjæres ved hjelp av en såkalt ultrotom og er 60 – 100 nanometer tykke. Snittene plukkes opp på et tynt kobbernett (engelsk ”grid”), som har en diameter tilpasset elektronmikroskopets preparatholder (25, 26).
Kontrastdanning i vevet er en forutsetning for at elektronstrålene skal kunne gi en avbildning av vevsstrukturene. Denne kontrasten fremkommer ved at ulike komponenter i vevet har ulik evne til spredning/absorpsjon av elektronstrålen. Spredningen skyldes en gjensidig påvirkning mellom elektronstrålen og atomkjernene og/eller elektronene i preparatets atomer. Biologiske prøver består hovedsakelig av atomer med lav masse, slik som karbon, nitrogen, oksygen og hydrogen, og har relativt dårlig spredningsevne. For å øke spredningen og dermed kontrasten må vevet tilføres salter av tungmetaller som osmium, uran og bly. Cellemembraner tar f.eks. opp osmium, og fremstilles ved høy kontrastvirkning som sorte, veldefinerte strukturer på de fotografiske bildene (24).
Anvendt forstørrelse ved den elektronmikroskopiske undersøkelse vil være avhengig av den aktuelle problemstilling. Selv om den maksimale forstørrelse eller oppløsningsevne er betydelig høyere for de mest avanserte elektronmikroskoper, vil et vanlig arbeidsområde ved den patologisk-anatomiske diagnostikk være fra 2 000 til 4 000 ganger og opp til 40 000 – 50 000 ganger. Til sammenlikning gir lysmikroskopet opp til 400 – 600 ganger forstørrelse med ”tørrlinser” og 1 000 ganger ved bruk av immersjonsolje.