Væskestrømscytometri – anvendelse i cellebiologi og nytte i klinisk medisin

Nytten av væskestrømscytometri i klinisk medisin

Inkluderer vi klinisk forskning, er nytten av væskestrømscytometriske undersøkelser betydelig innenfor en rekke felter i klinisk medisin. Her må nevnes undersøkelser knyttet til tumorbiologi og onkologi, hvor studier av cellevekst og programmert celledød står sentralt. Ulike metoder brukes for karakterisering av svulstvekst med henblikk på prognose og behandlingsrespons, inkludert undersøkelser av medikamentresistens og minimal restsykdom. Et stort behov for væskestrømscytometriske analyser er det også innenfor hematologi, onkologi og infeksjonsmedisin, hvor karakterisering av leukocytt-subpopulasjoner ved infeksjoner, immundefekter og neoplasier står sentralt. I klinisk forskning er også muligheten for cellesortering av stor betydning, idet man kan sortere ut celler med spesielle fenotypiske karakteristika og gjøre funksjonelle og genetiske undersøkelser for nærmere klassifisering.

Definerer vi klinisk medisin kun til å omfatte de rutinemessige diagnostiske og behandlingsmessige prosedyrer knyttet til pasientbehandling, er bruken av væskestrømscytometri noe mer begrenset hva gjelder anvendelsesområder. De klinisk-kjemiske avdelingene er helt klart de største brukerne av denne teknologien, da differensialtelling av leukocytter i de moderne helautomatiske celletellerne skjer ved hjelp av væskestrømscytometri. Leukocyttenes lysspredningsegenskaper er alene grunnlaget for identifikasjon i noen instrumenter, mens andre kombinerer lysspredningsegenskaper med cytokjemiske egenskaper (peroksidase). Utskriftene fra disse moderne instrumentene inneholder store mengder informasjon som kan nyttiggjøres i den kliniske hverdagen, men som nok dessverre i liten grad benyttes av klinikerne. Lysspredningsplottene, spesielt når de er kombinert med cytokjemisk påvisning av peroksidase, kan bidra med verdifull infomasjon ved akutte leukemier og gi antydning om riktig subtype (FAB-klasse). Vi har særlig hatt nytte av lysspredningsplottene i oppfølging av pasienter med kronisk lymfoproliferativ sykdom (fig 2).

DNA-væskestrømscytometri av svulster for prognostisk vurdering er en metode som nyttes ved regionssykehusene i Norge og i utlandet. Det beste er å bruke ferskt tumormateriale som utgangspunkt, men celler kan også som tidligere nevnt isoleres fra parafinblokker slik at cellekjerner kan analyseres med svært godt resultat. Dette gjør det også lett å sende materiale for konsultasjonsanalyse til annet laboratorium. Figur 3 viser eksempel på DNA-fordeling fra et nevroblastom hos et barn hvor vi ser en dominerende aneuploid populasjon med kun få diploide celler, som sannsynligvis er betennelsesceller. I nevroblastomer og rabdomyosarkomer er DNA-aneuploidi en viktig prognostisk markør knyttet til god prognose. I de fleste andre tumortyper hvor aneuploidi er en prognostisk faktor, er den knyttet til dårlig prognose. De fleste sentre som behandler gynekologiske neoplasier bruker DNA-analyser som viktige prognostiske og behandlingsveiledende faktorer ved endometrie- og ovarialkarsinomer. Selv om DNA-aneuploidi er knyttet til dårlig prognose også ved brystkreft, urologiske neoplasier og kolorektal cancer, er rutinebruk av DNA-analyse ved disse kreftformer foreløpig begrenset.

Etter farging med AO kan man med væskestrømscytometri skille mellom denaturert og ikke-denaturert DNA i spermier. Metoden kalles SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay), og gir en uavhengig parameter for å forutsi infertilitet hos menn (7). Denne metoden etableres nå som rutineundersøkelse ved utredning av mannlig infertilitet ved flere større sentre i USA, og brukes også ved Rikshospitalet (fig 4). Ved genetiske laboratorier anvendes sortering av humane kromosomer som utgangspunkt for DNA-bibliotek og for å lage spesielle prober som anvendes i deres rutinemessige utredning av kromosomavvik.

Immunfenotyping er indisert ved de tilfeller av akutt leukemi hvor behandlingen har remisjon som målsetting for dermed å gi mulighet for helbredelse. For å kunne identifisere alle tilfeller av udifferensiert akutt myelogen leukemi (M0 AML) og megakarioblastleukemi (M7 AML) kreves immunfenotyping ved akutt myelogen leukemi (AML). For med sikkerhet å kunne stille diagnosen akutt lymfatisk leukemi (ALL) er immunfenotyping nødvendig. Ved samtlige regionsykehus i Norge benyttes væskestrømscytometri rutinemessig ved immunfenotyping av akutte leukemier. Dette bidrar først og fremst til en mer presis diagnose og har dermed betydning for den initiale behandlingen. Undersøkelsene har imidlertid også prognostisk betydning og er viktig for valg av konsolideringsbehandling, f.eks. ved identifikasjon av pasienter som er kandidater for allogen stamcelletransplantasjon i første remisjon. Det er først og fremst ved akutt lymfatisk leukemi (ALL) at dette har gyldighet. Tabell 1 viser et eksempel på immunfenotypisk klassifikasjon av akutte leukemier; den såkalte EGIL-klassifikasjonen (18).

Ved kroniske myeloproliferative sykdommer har immunfenotyping foreløpig ikke funnet noen plass. Derimot er immunfenotyping et meget nyttig hjelpemiddel i diagnostikken ved kroniske lymfoproliferative sykdommer hvor en presis diagnose både kan ha terapeutisk og prognostisk betydning. Når det foreligger blod- og/eller beinmargsaffeksjon er væskestrømscytometri særlig egnet for immunfenotypisk diagnostikk (fig 5). Tabell 2 viser hvordan den immunfenotypiske profilen kan bidra til en presis diagnose ved ulike kroniske lymfoproliferative sykdommer hvor blod- og/eller beinmargsaffeksjon er vanlig.

Ved leukemier og lymfomer er det ikke sjelden å finne at pasientene har pleuravæske eller ascites eller at det er mistanke om affeksjon av sentralnervesystemet. Væskestrømscytometri er velegnet for immunfenotypisk diagnostikk av celler fra pleuravæske, ascites og spinalvæske, men vår erfaring er at det i slike tilfeller er svært viktig at prøvematerialet blir preparert omgående for at resultatet av undersøkelsen ikke skal forringes betydelig. Dette er i kontrast til blod- og beinmargsprøver som iallfall kan ligge i romtemperatur i 24 timer før preparing uten at prøveresultatene endres.

Høydosebehandling med autolog stamcellestøtte er etablert behandling ved alle landets regionsykehus, og i dag er det nesten utelukkende stamceller fra blod som anvendes. Væskestrømscytometri benyttes for å kvantifisere CD34-positive celler i leukafereseproduktet. CD34 er et overflatemolekyl som uttrykkes på hematopoetiske progenitorceller inklusive celler med stamcelleegenskaper. Det må være et visst minimum av CD34-positive celler (vanligvis 2 × 106/kg kroppsvekt) i leukafereseproduktet for at det skal være egnet til stamcellestøtte etter høydosebehandling.

Væskestrømscytometri er også velegent i diagnostikken av ikke-maligne hematologiske sykdommer. Metoden er av stor verdi ved mistanke om paroksysmal nokturnal hemoglobinuri (PNH), og synes å kunne erstatte Hams test slik som omtalt i Tidsskriftet (19). Ved paroksymal nokturnal hemoglobinuri (PNH) resulterer en somatisk mutasjon i PIG-A genet på X-kromosomet i en global defekt i syntesen av GPI-ankre. Dette resulterer i utvikling av kloner av blodceller som mangler flere viktige overflatemolekyler, og det kan raskt og presist vises ved væskestrømscytometri.

I utredningen av pasienter hvor det er mistanke om medfødt eller ervervet immunsvikt, er også væskestrømscytometri en viktig del av det diagnostiske armamentarium. På en rask og presis måte kan antall B- og T-lymfocytter i blod bestemmes i likhet med subpopulasjoner av B- og T-lymfocytter så som CD4-positive T-lymfocytter ved HIV-infeksjon. Metoden kan også brukes til å evaluere effekt av behandling f.eks. økning av CD4-positive T-lymfocytter som følge av moderne retroviral behandling ved AIDS.

Trombocyttsykdommene Bernard-Souliers sykdom og Glanzmans trombasteni er karakterisert ved at blodplatene mangler henholdsvis membranmolekylet CD42 (glykoproteinkomplekset Ib-IX) og CD61 (glykoprotein IIIa). Væskestrøsmcytometri brukes rutinemessig i diagnostikken ved mistanke om disse sykdommene.