Molekylærbiologiske analyser av mikrodissekert vev
Mikrodisseksjon er i økende grad i bruk ved molekylærbiologiske studier. Molekylærbiologiske analyser som baserer seg på bruk av vev, er avhengig av fersktfryste eller formalinfikserte, parafininnstøpte vevsbiter.
De fleste patologiske avdelinger har store arkiver som består av vevsbiter fra diagnostikk og obduksjoner, samt snitt fra cytologiske prøver, biopsier og frysesnitt. Vevsbitene vil for det meste være behandlet med formalin og deretter innstøpt i parafin for at morfologien i de histologiske snittene skal bli best mulig. For preservering av DNA og RNA er ikke dette optimalt, men de siste tiår er det utviklet spesielle rensemetoder der man får DNA av en slik kvalitet at man kan gjøre fragmentanalyser eller mutasjonsanalyser. Resultatene er stort sett begrenset av at formalinet har en tendens til å stykke opp DNA-trådene slik at man bare kan analysere korte områder i genomet om gangen.
I de senere år er det kommet en rekke nye metoder som har gjort problemene mindre. I tillegg til polymerasekjedereaksjon har man fått mer sensitive metoder på flere trinn i prosessen slik at vevsmengden kan reduseres. Det har også vært utviklet anrikningsmetoder, f.eks. at man mangfoldiggjør genomet flere ganger ved hjelp av totalgenom-PCR forut for polymerasekjedereaksjon på det ønskede DNA-området (13). Analyser som baserer seg på mikrodissekert materiale, har stort sett vært avhengige av polymerasekjedereaksjon, og metodene som tidligere var mest brukt, er fragmentanalyser og mutasjonsanalyser. Ved fragmentanalyser påviser man tilstedeværelse av bestemte mikrosatellitter som er spredt i genomet (14). Endringer av disse indikerer muligheten for endring av sentrale gener i nærheten. Ved å bruke mikrodisseksjon for å få rene cellepopulasjoner erfarte vi en markant økning av informasjon (15). Metodens begrensning lå i fragmentlengden, som ikke måtte være over 150 basepar. Fragmentanalyser har vært brukt for å se sammenheng mellom ulike stadier av brystkreft. Man har gjenfunnet de samme tap av DNA-områder i in situ-komponenter som i invasivt karsinom-komponenter (16) samt i atypiske duktale hyperplasier (17). Liknende studier er også utført for andre krefttyper, hvor man forsøker å ”tidfeste” ulike genetiske hendelser i forhold til den morfologiske tumorutviklingen.
Når det gjelder mutasjonsanalyser, har man brukt mange ulike teknikker, både direkte sekvensering, ”single-strand conformation polymorphism” (SSCP), ”constant denaturant gel electrophoresis” (CDGE) og andre for å påvise enkeltbaseendringer. En svensk gruppe har arbeidet mye med mutasjonsanalyser av genet TP53. Gruppen var blant de første som benyttet mikrodisseksjon og mutasjonsanalyser sammen med immunhistokjemi for å kartlegge lokalisering av genetiske forandringer innad i tumoren (18, 19). Man fant at både invasiv og ikke invasiv cancer viste heterogenitet innad i tumoren. I den senere tid er det også publisert resultater som indikerer at fiksering i formalin kan indusere mutasjoner, slik at arkivmateriale overhodet ikke egner seg til mutasjonsanalyser (20). Dette gjenstår det å få bekreftet eller avkreftet.
Man har nå flere metoder for å screene større områder av genomet. En av disse er ”comparative genomic hybridisation” (CGH). Denne metoden har det også vært mulig å benytte på mikrodissekert materiale (21).
Analyser av enkeltceller kan være verdifullt, særlig innen hematopatologien, hvor det kan være vanskelig å avgjøre celletype og klonalitet. Man har gjort mikrodisseksjon av celler fra snitt som det på forhånd var utført immunhistokjemi eller in situ-hybridisering på (22). Dette gir informasjon på flere nivåer om en enkelt celle, både om genforandringer og proteinendringer, og kan gjøre diagnostikk lettere.
Hvilke gener som den aktuelle cellen faktisk uttrykker, kan analyseres ved ulike teknikker. På cDNA-nivå har man utviklet ”microarrays” som muliggjør analyser av tusenvis av cDNA-kloner på én gang (23). Mikrodissekert materiale har foreløpig ikke vært mye brukt, da metodene har krevd mye vev for å gi optimalt resultat. Dette har til dels vært løst ved bruk av fersktfryst vev (24).
Analyser på proteinnivå har også vært avhengig av store mengder vev, slik at mikrodisseksjon for å få rene tumorcellepopulasjoner har vært lite brukt. Todimensjonal fremstilling av alle proteiner i en prøve, ”two-dimensjonal polyacrylamide gel electrophoresis” (2D-PAGE), viser ikke bare mengden av de forskjellige proteinene, men også eventuelle modifikasjoner. Nylig har man klart å analysere mikrodissekerte celler også med denne metoden (25).