PCR-teknikken
Før en polymerasekjedereaksjon kan settes opp, må DNA (eller RNA) isoleres fra det prøvematerialet man ønsker å undersøke. Dette gjøres ved koking, enzymatisk behandling (proteinase-K) eller ved bruk av organiske løsemidler (fenol, kloroform). Til diagnostiske formål er det nå vanlig å bruke kommersielle analysesett. Både ferskt, fryst og formalinfiksert, parafininnstøpt materiale kan brukes. Svært lite materiale er nødvendig; i prinsippet er en enkelt celle tilstrekkelig. DNA kan også isoleres fra fargede celleutstryk og vevssnitt. Dette gjør teknikken meget anvendelig i diagnostisk patologi.
Når DNA er isolert, kan reaksjonsblandingen settes opp. Denne må inneholde templat (prøve-DNA), buffer, to primere og deoksyribonukleotidtrifosfater, som er byggesteiner for DNA-polymerasen. DNA-polymerase er et enzym som syntetiserer en ny DNA-tråd når de andre komponentene i reaksjonsblandingen er til stede. Nå brukes varmestabil Tac-polymerase som tåler temperaturer opp mot kokepunktet, slik at den ikke må tilsettes etter hvert denatureringstrinn.
Når reaksjonsblandingen er ferdig laget, kan PCR-analysen settes i gang. De ulike trinnene i en polymerasekjedereaksjon er illustrert i figur 1. Flankesekvensene til den DNA-biten som ønskes oppformert, må være kjent. Primere er syntetiske oligonukleotider som er 18 – 28 basepar lange. De fungerer som en startsekvens for DNA-polymerasen, og er komplementære til flankesekvensene til hver sin DNA-tråd. Primervalg er svært viktig og bestemmer reaksjonens sensitivitet og spesifisitet.
Etter at PCR-analysen er kjørt, er det nødvendig å kontrollere resultatet. Dette kan gjøres på ulike måter. Gelelektroforese av PCR-produktet er vanlig, og vil bli vist i de kasuistikkene som presenteres i denne artikkelen. PCR-produktene kan også kontrolleres med restriksjonsfragmentlengdepolymorfisme (RFLP), Dot blot eller Southern blot med hybridisering med spesifikke prober og sekvensering.
Teknikkens styrke er dens høye sensitivitet, men dette kan også være en ulempe. Kontaminasjon i laboratoriet, mangel på gode kontroller og uspesifikke primerreaksjoner kan gi falskt positive resultater. De negative kontroller bør bestå både av en blindprøve og en kontaminasjonskontroll. Blindprøven, som ikke inneholder prøve-DNA, kontrollerer for forurensning under tillaging av reaksjonsblandingen. Kontaminasjonskontrollen, som er fra en tom parafinblokk eller fra et vev som ikke inneholder det agens eller det kromosomavvik man leter etter, kontrollerer for forurensning under DNA-ekstraksjonen.
Falskt negative resultater kan skyldes primerseleksjon. Den rearrangeringen man ønsker å påvise, kan for eksempel sitte utenfor det området hvor primerne fester seg. Basesammensetningen er viktig for at primerne skal sitte godt på templatet. De to primerne må ha samme smeltepunkt, og 3’-enden må hybridisere stabilt til templatet. Det er også viktig at det ikke er homologi mellom de to primerne, ellers vil de hybridisere til hverandre istedenfor til templatet.
DNA-kvalitet er svært viktig for å få til en vellykket polymerasekjedereaksjon. For lite DNA kan gi falskt negative resultater. Ekstraksjon av DNA fra formalinfiksert, parafininnstøpt materiale kan gi svært degradert og kuttet DNA. Det er da viktig å velge primere som gir et kort PCR-produkt; helst< 250 basepar, for å unngå falskt negative resultater (4, 5).
Falskt negative resultater kan også forårsakes av metodologiske faktorer. Man kan for eksempel ha glemt å tilsette en av komponentene i reaksjonsblandingen, det kan være feil temperaturkontroll i PCR-maskinen eller feil MgCl2-konsentrasjon i reaksjonsbufferen. For å unngå falskt positive og falskt negative resultater er det svært viktig å jobbe sterilt, med atskilte laboratorier og en DNA-fri sone. PCR-resultatene er ikke pålitelige uten godkjente positive og negative kontroller.